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日本血吸虫蛋白磷酸酶PP2C-1的原核表达及活性分析
目的 构建日本血吸虫PP2C-1蛋白磷酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析. 方法 从日本血吸虫基因组数据库中找到一个可能编码PP2C-1蛋白磷酸酶的基因Sj-PP2C-1,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区与pET28a表达载体连接后转化大肠埃希菌并用IPTG诱导表达,对表达产物的磷酸酶活性进行分析. 结果 成功构建了Sj-PP2C-1蛋白磷酸酶表达载体,其编码区能够在大肠埃希菌中表达分子质量单位为40 ku的目的蛋白;采用V2460系统进行检测,Sj-PP2C-1具有PP2C磷酸酶活性. 结论 Sj-PP2C-1基因原核表达产物具有蛋白磷酸酶活性,为研究PP2C类蛋白磷酸酶的功能打下了基础.
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FHIT基因研究进展
早在1979年,Cohen等就发现一家族性早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌与t(3:8)染色体易位有关.此后,人们在肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中观察到3号染色体短臂的高频率缺失,提示在3p上可能存在抑癌基因.1996年,Ohta等[1]用差异显示分析探针和外显子捕获法在3p14.2上确定了一个新的基因,由该基因cDNA推算的蛋白质与具有3价组氨酸结构域的HIT蛋白质家族高度同源,又因为此基因跨越脆性位点(fragile site),故将之命名为FHIT(fragile histidine triad)基因.FHIT基因全长超过1 Mb,为一高度保守的基因序列,其mRNA全长约1.1 kb,包含10个外显子,由第5～9外显子编码一个相对分子质量约为16 800的蛋白.Barnes等[2]通过蛋白质活性分析证实,人类FHIT蛋白是一典型的二腺苷酸三磷酸水解酶(Ap3A),催化Ap3A水解为ADP和AMP,FHIT蛋白质水解酶活性丧失将导致Ap3A水平升高.
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常用抗生素对肺炎支原体的抗菌活性分析
2003年6月-2006年6月,我们通过药物敏感试验测定肺炎支原体(MP)分离株庆大霉素、四环素、环丙沙星的小抑菌浓度(MIC),以了解庆大霉素、四环素、环丙沙星对MP的抗菌活性,寻求对MP尤其是耐药MP有效的药物.
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眶内嗜酸性肉芽肿三例
例1 患者男,15岁.因右眼眶区疼痛2个月,右眼眶肿物1周就诊.体格检查:右眶外侧肿物约1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小,质地中等,边界不清,活动差,无压痛.化验室检查:外周血嗜酸细胞计数为440×106/L,血T-淋巴细胞rDNA转录活性分析(Ag-NORS)检测结果(核仁/核)为4.57%,肝功能检查碱性磷酸酶升高.MRI报告:右眼眶泪腺区异常信号肿物,中等T1,稍高T2信号,边缘模糊不清,邻近眶壁骨质破坏,右眼球未见异常信号.病理报告:右眶内嗜酸性肉芽肿.免疫组织化学染色结果:S-100蛋白阳性.既往曾行抗炎治疗,无效,行肿物刮取术,术中见肿物无完整包膜,与眶骨膜粘连紧密,部分眶壁受侵.术后采用6 MV X射线外照射,照射野为肿瘤局部及受累眶骨(注意保护全眼球),DT30 Gy,分17次,3.4周完成,肿物消失,随访8个月无复发.
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基于原代小脑颗粒细胞的A型肉毒毒素活性分析法的建立
目的 分离、培养SD大鼠原代小脑颗粒细胞,用于评价A型肉毒毒素活性.方法 将出生后6~8 d的SD大鼠小脑颗粒细胞培养5~7 d后用A型肉毒毒素处理,采用免疫荧光法进行检测并评价毒素的活性,Western印迹法分析毒素活性与剂量关系.结果与结论 成功培养了大鼠小脑颗粒细胞,并在原代神经细胞水平建立了A型肉毒毒素活性分析法,测定了毒素活性剂量关系,为进一步解析肉毒毒素作用的生化机制提供了技术手段.
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4种省沽油属植物总酚类物质抗氧化活性的研究
目的:比较省沽油属4种植物干燥叶片中不同提取部位总酚类物质含量及其抗氧化活性测定,为开发利用打下基础.方法:用70%乙醇提取各植物干燥叶片,浓缩得乙醇浸膏,并用系统溶剂萃取法得到乙酸乙酯和氯仿两个部位;然后采用改良的Folin-Ciocalteu比色法测定各植物各部位总酚类物质含量,并通过DPPH氧化自由基清除活性实验及抗过氧化亚硝酸盐硝化活性实验分析各总酚类物质抗氧化活性.结果:比色法结果表明.四种植物中乙酸乙酯部位总酚类物质含量均高于氯仿部位,其中省沽油干燥叶片乙酸乙酯部位总酚类物质含量高,抗氧化活性强.结论:省沽油属植物叶片中含有活性酚类物质,其中省活油叶片乙酸乙酯部位含量高,活性曩强,值得进一步开发利用.
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巴音毛道地方性砷中毒病区井水中微量元素的特征
目的为了评价饮水型砷中毒病区巴音毛道农场井水中不同种态砷及其它微量元素含量对砷中毒的危险性.方法用中子活化法测定了总As、As3+、As5+、甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)以及、Fe、Ba和稀土元素等.结果表明井水中水砷含量严重超过国家饮用水水质标准,井水中的砷大多为无机砷,其中As3+占65%～88%.MMA+DMA仅占水砷的1%～6%.Fe和Ba的含量明显高于水质标准,稀土元素的浓度为世界淡水元素背景值的几十倍到几百倍.结论水砷含量越高,病人病情越重.在水砷含量相近的情况下,As3+含量越高,病情越重.Fe、Ba和稀土元素等微量元素可能加重砷的中毒.
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野生型和突变型人白介素13的大肠杆菌表达及活性分析
利用大肠杆菌表达野生型和突变型重组人白介素13(IL-13),以获得具有生物学活性的重组蛋白.采用PCR方法从质粒pET22b-hIL-13上扩增人成熟IL-13的编码序列.用定点突变引物扩增IL-13突变体(IL-13m)编码基因.将IL-13和IL-13m编码基因分别克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建质粒pET28a(+)-IL-13和pET28a(+)-IL-13m,然后将质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,构建重组体,IPTG诱导重组蛋白表达.重组蛋白采用镍柱(Ni-NTA)纯化,纯化后复性,并分析其生物学活性.结果成功得到IL-13和IL-13m重组蛋白,经SDS-PAGE分析.在相对分子质量约14.6 kD的位置出现明显蛋白条带,经Western blot证实为重组hIL-13蛋白;重组蛋白主要以包涵体形式存在.纯化复性后,重组蛋白具有生物学活性.后成功获得了具有生物学活性的野生型和突变型重组人IL-13,为后续研究奠定了基础.
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羧肽酶A1及其活性中心基因的表达及活性分析
目的:克隆羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)全酶及其活性中心基因,构建重组表达载体进行诱导表达,分析表达产物活性.方法:RT-PCR扩增CPA1全酶及活性中心基因,测序分析后将目的基因克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实插入方向正确后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达目的基因后SDS-PAGE电泳分析.目的蛋白经变性、复性、纯化后MTT法和集落形成试验鉴定其活性.结果:获得了人CPA1全酶及活性中心基因,目的基因诱导表达后约66 kD及46 kD处可见新生蛋白带;活性分析显示CPA1全酶和活性中心蛋白都具有一定的催化水解活性,但后者对肿瘤细胞的杀伤效果较弱.结论:能成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因,获得了二者的原核表达产物,体外具有一定活性.可望以人羧肽酶A1全酶及其活性中心基因为新起点,继续完善优化羧肽酶A1系统,为抗体靶向治疗前列腺癌的临床应用奠定基础.
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297株耐甲氧西林葡萄球菌对β-内酰胺类等抗生素体外活性分折
通过MRS对8种β-内酰胺类等抗生素体外活性分析,了解其耐药性,指导临床正确使用抗菌药物.采用K-B法,按NCCLS 2000年公布的标准判断结果.
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家蚕的蜕皮激素受体和超气门蛋白在大肠杆菌中的共表达和纯化
构建蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)的表达载体,使两者在大肠杆菌内高效共表达,获得具有活性的目的蛋白,即EcR和USP的复合蛋白(EcR-USP).将N端带有6×His tag的EcR目的基因片段克隆于pET21bMDX12(+)载体内,将N端带有6×His tag的USP目的基因片段克隆于pET28a(+)载体内,并将两个重组质粒同时转化入同一宿主菌BL21(DE3)内利用IPTG低温诱导双基因共表达,选用“超声破碎法”提取共表达蛋白,色谱柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot分析纯化结果,MicroCal iTC200法与小分子化合物20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)相互作用进行活性分析.SDS-PAGE与Western Blot分析结果显示宿主菌中表达产物存在蛋白复合体,大小与预期相符,MicroCal iTC200实验显示EcR-USP与20E有结合,即EcR-USP有活性.得到有活性的家蚕的EcR-USP的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础.
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阿达木单抗抗原结合片段在大肠杆菌中的共分泌表达和纯化
构建阿达木单抗抗原结合片段(Fragment antigen binding,Fab)表达载体,使其在大肠杆菌内高效共分泌表达,周质空间中获得具有活性的目的蛋白.将带有信号肽的Fab片段重链与轻链克隆于带有双启动子的pETDuet-1载体内,BL21(DE3) Star宿主菌内利用IPTG低温诱导双基因共分泌表达,选用“渗透压冲击法”提取周质蛋白,色谱柱纯化,Western blot分析纯化结果,与纯化的人肿瘤坏死因子(TNF-α)相互作用进行活性分析.SDS-PAGE与Western blot分析在细胞周质中同时存在重链和轻链,大小与预期相符,ELISA试验显示Fab片段与TNF-α结合.结论:得到有活性的人源的阿达木单抗的Fab的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础.
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食淀粉乳杆菌淀粉酶基因在E.coli中的克隆表达
以食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)总DNA为模板,通过PCR扩增得到约1.3kb的α-淀粉酶基因保守区片段amyC.经双酶切插入到表达载体pET-32a的NcoI和NotI之间,转化大肠杆菌BL21( DE3)菌株.经IPTG诱导表达后,发酵液淀粉酶总活性为3 623 u/L,培养液上清和细胞破碎液上清均有淀粉酶活性,分别为3.3 u/mL和14.1 u/mL.破碎上清经镍柱纯化后,得到单一的目的条带,纯化蛋白的比活力为26.9 u/mg蛋白,比纯化前(3.9 u/mg蛋白)提高了大约7倍.
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苦瓜MAP30蛋白功能区段缺失体构建及其生物活性研究
通过PCR技术从质粒pET30a-MAP30中分别得到编码M1(D1-K195)、M2(D1-E187)、M3(A11-K195)、M4(A11-E187)4个功能区段缺失体蛋白的序列,经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pET22b中,表达载体用CaCl2介导的化学转化法转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞,然后利用菌落PCR筛选阳性克隆.工程菌在28℃时经1 mmol/L IPTG诱导5 h时实现高效表达,4种重组蛋白在大肠杆菌中都以包涵体形式存在.利用MTT法分析4个重组蛋白复性液的抗肿瘤活性,结果表明4个功能区段缺失体重组蛋白均对人羊膜细胞系wish、鼠髓白血病细胞系NFS-60、小鼠腹水瘤细胞S-180有杀伤作用,其中对鼠髓白血病细胞系NFS-60抑制作用明显.M1、M2、M3和M4 4个缺失体重组蛋白对NFS-60作用的IC50分别为2.51、2.42、1.89μg/ml和1.90μg/ml.细胞毒性分析表明,4个重组蛋白对人正常肝细胞系HL-70的细胞毒性极小,且都低于重组MAP30蛋白的细胞毒性.
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改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析
利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高.应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了佳摇瓶发酵条件:培养基适pH值5.5～6.5,佳甲醇诱导浓度为1%,适甲醇诱导周期为96 h.筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS11 5、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS11 5、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145 mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性.对TRAlL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达.
关键词： 毕赤氏酵母 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 高效表达 活性分析 -
炭疽杆菌致死因子LF253的制备及活性分析
目的:制备具有生物学活性的重组致死因子253 (lethal factor 253,LF253)抗原,获得纯化的目的蛋白,检测其与全分子致死因子(lethal focfor,LF)蛋白竞争性结合保护性抗原(protective antigen,PA)的能力.方法:PCR扩增致死因子LF253片段的DNA,将目的基因插入pET-28a(+)表达载体中,利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌,IPTG诱导重组蛋白表达,通过His标签亲和层析柱获得目的蛋白,Western blot和ELISA法检测蛋白抗原性,Biacore T-100测定重组蛋白与保护性抗原PA结合的亲和力,细胞毒性实验检测其生物学活性.结果:成功构建原核表达载体pET-28a/LF253,诱导获得重组蛋白sLF253的表达.Western blot和ELISA检测结果证实,该重组蛋白具有良好抗原特异性;细胞毒实验结果表明,重组蛋白可在体内外中和致死毒素引起的生物学效应.结论:本研究制备的融合蛋白sLF253能够与保护性抗原PA结合,可竞争性抑制LF全分子蛋白与PA的聚合,阻断炭疽毒素的致死作用,为今后炭疽疫苗等药物的研发奠定了基础.
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肝片吸虫组织蛋白酶L真核表达载体构建及重组蛋白活性分析
目的 构建肝片吸虫组织蛋白酶L(CatL)的真核表达载体,研究重组蛋白的生物学活性.方法 以构建好的重组质粒pET30a-FhCatL为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫组织蛋白酶L基因(catL),连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-CatL,转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况.结果 重组质粒pEGFP-N1-CatL在HeLa细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应.结论 肝片吸虫CatL真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有免疫反应性,可做为分子疫苗的候选和诊断抗原进行进一步的研究.
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肝片吸虫GST真核表达载体构建及重组蛋白活性分析
目的 构建肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶(GST)的真核表达载体,研究重组蛋白的免疫原性.方法 以构建好的重组质粒pET30a-FhGST为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(GST),连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-GST,转染Hela细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况.结果 重组质粒pEGFP-GST在Hela细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应.结论 肝片吸虫GST真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有生物学活性,可做为分子疫苗的候选进行进一步的研究.
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日本血吸虫T2核酸酶的原核表达及活性分析
目的 构建日本血吸虫T2核酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析.方法 从日本血吸虫基因组数据库中找到与曼氏血吸虫虫卵抗原Omega-1同源性高的蛋白AY814845,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区连入pET32a表达载体,转化大肠杆菌并用IPTG诱导其表达,后对表达产物的核酸酶活性进行分析.结果 成功的构建了日本血吸虫T2核酸酶的表达载体,其编码区能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有一定的核酸酶活性.结论 从体外扩增了日本血吸虫T2核酸酶AY814845,明确其表达产物具有核酸酶活性,为今后深入研究该蛋白的功能打下了基础.
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长白山特殊生境药用植物根际拮抗菌的分离及其代谢产物活性分析
目的 从长白山特殊生境土壤中分离筛选出具有抗Staphylococcus aureaus与Escherichia coli两种临床常见指示菌效果明显的菌株.方法 通过对菌株的初步分离,纯培养,革兰染色,抑菌实验,摇瓶发酵,形态特征等进行综合实验分析,优选具有较好抑菌作用的菌株.结果 通过筛选,终从16株形态典型的菌株中成功分离出2株具有明显抑菌效果的菌株,命名为D-x和D-f;菌株D-x与D-f发酵液上清及浸膏对两种靶标菌均具有明显的抑菌活性;D-x上清液对S.aureaus及E coli的平均抑菌圈直径分别为13.8 mm和9.8 mm,浸膏对S.aureaus及E.coli的平均抑菌圈直径分别为10.5mm,7.2mm;D-f上清液对S.aureaus及E.coli平均抑菌圈直径分别达到12.5mm,10.8mm,浸膏对S.aureaus及E.coli平均抑菌圈直径分别达到9.6 mm,9.5 mm.结论 通过筛选,菌株D-x与菌株D-f均具有较好抑菌活性,是两株值得开发的抗菌菌株.
