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恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端19ku片段(MSP1-19)的表达及免疫效应检测
目的探讨恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1 C末端19 ku片段(MSP1-19)重组蛋白的免疫活性. 方法利用毕赤酵母高效表达系统分泌表达MSP1-19,表达产物纯化后免疫新西兰兔,3次免疫后ELISA检测其血清中IgG滴度的变化,观测重组MSP1-19免疫效应. 结果 MSP1-19在毕赤酵母高效表达;重组MSP1-19免疫后,兔血清中IgG滴度的变化与对照组有显著差异. 结论 MSP1-19重组蛋白具有较好的免疫原性.
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HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母的研究
目的:实现HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母.方法:分别将乙肝病毒前S1蛋白和绿色荧光蛋白克隆到表达载体pPIC9K,获得重组质粒pPIC9K-EGFP-preS1,Sac1位点酶切线性化,采用醋酸锂(LiAc)和二硫苏糖醇(DDT)对巴斯德毕赤氏酵母Pichia Pastoris GS115预处理,在电压1.5 kv、电容25 F条件下进行电击转化.电击后立即迅速稀释在冰预冷的1 M的山梨醇中,混匀后取100 l的菌液均匀涂布YNBG平板,利用HIS4标记筛选转化子.结果:发现改进后的转化方法pPIC9K-EGFP-preS1的转化率提高到164×10 4个转化子/1μgpPIC9K-EGFP-preS1 DNA,是传统方法的6.6倍.结论:采用改进后的方法能有效的提高质粒pPIC9K-EGFP-preS1的转化率,为筛选高表达HBV PreS-EGFP融合蛋白的转化子打下基础.
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碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在毕赤酵母中的异源表达
碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ, CA Ⅱ）是参与机体多种代谢活动和病理活动的一种重要催化酶。通过基因重组、电转化等方式，得到能异源高表达人 CA Ⅱ的毕赤酵母（Pichia. pastoris）GS115工程菌。对工程菌进行培养及甲醇诱导后，经离子交换层析柱分离纯化后得到较纯的重组 CA Ⅱ。通过 Western blotting、酶活力及圆二色谱检测发现重组和商品化 CA Ⅱ具有相似的酶活力和构象，为 CA Ⅱ今后进一步在临床的研究和工业应用打下了基础。
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改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析
利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高.应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了佳摇瓶发酵条件:培养基适pH值5.5～6.5,佳甲醇诱导浓度为1%,适甲醇诱导周期为96 h.筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS11 5、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS11 5、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145 mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性.对TRAlL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达.
关键词： 毕赤氏酵母 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 高效表达 活性分析 -
毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析
为了探索利用毕赤氏酵母系统表达和生产人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,hGM-CSF)的可行性,使用经改造的hGM-CSF基因构建pGAPZα-A/hGM-CSF分泌型表达载体,转入毕赤氏酵母SMD1168(his 4,pep 4)菌株和GS115(his 4)菌株,利用斑点杂交技术筛选hGM-CSF基因阳性菌株,利用SDS-PAGE和TF-1依赖细胞株/MTT比色法对工程菌株的分泌产物进行表达和生物活性分析,后筛选得到7个hGM-CSF基因阳性菌株,其中有3个工程菌株的杂蛋白较少且主带蛋白质相对分子质量与经改造的hGM-CSF基因相对分子质量保持一致,这3个工程菌株的分泌蛋白质样品都具有天然hGM-CSF的生物活性,经初步提取,活性单位分别为2.28×105U/ml、2.22×105U/ml和2.46×105U/ml.从而证明利用毕赤氏酵母系统表达hGM-CSF是可行的,为hGM-CSF的生产和临床应用打下了基础.
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人胰岛素样生长因子I在毕赤氏酵母中的表达研究
利用PCR定点突变技术对人胰岛素样生长因子(huIGF-I)基因进行改造,克隆到pGEMT载体测序.并构建酵母表达载体pGaAIGF-I,转化毕赤氏酵母GSn5.摇瓶发酵4 d后,检测表达水平占可溶性总蛋自的15%以上,且表现出较好细胞增殖活性.
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恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因在毕赤酵母系统中的高效表达
目的利用毕赤酵母高效表达系统表达用于下游实验的恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)重组蛋白.方法将测序正确的AMA-1(Ⅲ)基因插入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k中,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115,筛选高拷贝转化子,利用甲醇进行诱导表达.表达产物用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测.结果 AMA-1(Ⅲ)蛋白表达于培养上清,蛋白的相对分子质量分别为16.3ku,免疫印迹结果表明AMA-1(Ⅲ)基因表达蛋白能被抗AMA-1(Ⅲ)的单抗所识别,出现特异条带,推算AMA-1(Ⅲ)蛋白的表达量为0.8g/L.结论酵母细胞表达系统可高效表达在构象方面接近天然蛋白的AMA-1(Ⅲ)重组蛋白.
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恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1 C末端片段在毕赤酵母表达系统的高效表达与纯化
目的利用毕赤酵母表达系统高效表达并获得纯度较为理想的恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1 C末端片段(MSP-119)重组蛋白.方法将带有6-his基因的MSP-119基因序列插入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k中,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115,筛选出高拷贝转化子,优化表达条件,利用甲醇进行诱导表达.表达产物用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测.结果毕赤酵母分泌表达MSP-119蛋白,免疫印迹结果表明MSP-119基因表达蛋白能被抗MSP-119的单抗所识别,出现特异条带,将培养上清利用Ni-NTA柱纯化后,推算MSP-119蛋白的表达量为1.0g/L.结论酵母细胞表达系统可高效表达可免疫识别的MSP-119重组蛋白.
