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贵州包装饮用水中 污染情况分析
铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，存在于空气、土壤、水体、动物和人皮肤、呼吸道及肠道中。铜绿假单胞菌能够产生溶于水的绿脓菌素、荧光色素、红脓菌素，同时该菌还能够产生内毒素、胞外毒素、外毒素A等十余种致病因子，其中外毒素A为重要的致死因子。在食品检测领域，铜绿假单胞菌是一种非常重要的水源性致病菌，其广泛存在于水源水及各类型包装饮用水中。近年来，随着包装饮用水生产和消费量的不断上升，铜绿假单胞菌污染包装饮用水的报道逐渐增多，甚至引起食物中毒。现阶段，包装饮用水中铜绿假单胞菌污染的问题日益受到重视，包装饮用水中的铜绿假单胞菌已经成为各级监管部门和检测机构重点监测的对象。包装饮用水新国标 GB19298-2014于2015年5月24号正式实施，新国标修改了微生物指标与限量，铜绿假单胞菌被列为必检的微生物检测项目之一。为了掌握新国标实施以来贵州省内生产和销售的包装饮用水中铜绿假单胞菌污染的情况，本文共检测了291个批次的包装饮用水，结果分析如下。
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金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分离鉴定中的体会
目的 从上级单位质控考核样本中分离金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌.方法 按<消毒技术规范>2002年版对质控样本进行增菌、分离和鉴定.结果 菌落特征:盲样样本在血平皿上呈白色并具有溶血环菌落,在十六烷三甲基溴化铵琼脂平皿上呈灰白色边缘不整齐菌落.形态染色结果:盲样样本中白色有溶血环、微凸起、边缘整齐的菌落和ATCC6538及ATCC12228为革兰阳性(G+)葡萄状球菌,盲样样本中白色有溶血环,扁平、边缘不整齐菌落和ATCC90278为革兰阴性(G-)无芽胞杆菌.将G+葡萄状球菌做金黄色葡萄球菌的生化鉴定,结果盲样样本和ATCC6538均为阳性,而ATCC12228只有H2O2酶试验和葡萄糖发酵试验为阳性;将G-无芽胞杆菌做铜绿假单胞菌的生化鉴定,结果盲样样本和ATCC90278的绿脓菌素在培养24 h为阴性,培养48 h为阳性,不能液化成品明胶和12%的明胶,能液化11%的明胶,能还原硝酸盐,42℃生长试验阳性.结论 金黄色葡萄球菌在血平板上有时为白色菌落,色素只是判别金黄色葡萄球菌多个因素中的一个因素,检验人员不能仅根据色素做出判定,否则容易做出错误的结论;铜绿假单胞菌绿脓菌素试验24 h可能为阴性,必要时可以延长培养时间;在铜绿假单胞菌明胶液化试验中,要根据实际情况把握好明胶的浓度和菌种的接种量,否则会造成假阴性,对铜绿假单胞菌的判定造成困惑.
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下呼吸道感染铜绿假单胞菌产绿脓菌素及生物膜形成能力与耐碳青霉烯类抗菌药物相关性分析
目的：探讨下呼吸道感染铜绿假单胞菌的绿脓菌素分泌水平、生物膜形成能力与碳青霉烯类药物耐药性关系，为临床抗感染治疗提供依据。方法收集2013年1－6月从患者痰液中分离到的60株铜绿假单胞菌，菌种鉴定采用VITEK‐2全自动微生物分析仪；药敏测定采用K‐B法；通过96孔板生物膜形成试验分析菌株生物膜形成能力；绿脓菌素通过氯仿萃取法测定；采用随机扩增多态性DNA法进行耐菌株的基因分型。结果60株铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率高达41．7％，对头孢吡肟和哌拉西林／他唑巴坦的耐药率较低，均为16．7％，25株亚胺培南耐药菌株在绿脓菌素产生及生物膜形成能力上要明显高于敏感株；25株耐药菌株分为8个基因型。结论产绿脓菌素和生物膜形成能力强的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药率高，临床不宜选用该类药物进行抗感染的经验治疗。
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不同氧浓度对铜绿假单胞菌生长和毒力的调节作用
目的 研究不同氧浓度对铜绿假单胞菌生长及毒力的调节作用,阐明氦氧饱和高气压潜水富氧环境中铜绿假单胞菌感染高发机制.方法 以铜绿假单胞菌PAO1 (ATCC15692)为研究对象,主要设置实验对照组(20％ O2)、富氧实验组(40％ O2)、低氧实验组(2％O2)共三个暴露组.用半固体培养基、丛集运动培养基观察细菌生长及运动能力,绿脓菌素测定培养基结合光密度法测定绿脓菌素含量.用HE染色结合CCK-8方法,观察细菌培养上清对靶细胞A549的损伤效应.结果 与对照组相比,富氧环境生长的细菌克隆厚、中心明显隆起,运动生长轨迹不明显;低氧环境生长的细菌克隆中心凹陷、平铺生长,细菌运动生长轨迹显著.相较于实验对照组,低氧实验组绿脓菌素分泌能力降低(0.38±0.08vs 0.16±0.03,F=10.22,P=0.033),富氧浓度组绿脓菌素分泌能力增加(0.38±0.08 vs 0.66±0.06,F=24.00,P=0.008).细胞毒性检测显示,与空白对照组(F=93.55,P=0.001)和实验对照组(F=14.69,P=0.019)相比,富氧暴露生长细菌分离上清与细胞共培养8h后,靶.细胞出现明显损伤效应.结论 富氧浓度可通过调节铜绿假单胞菌生长、运动及毒力,诱导铜绿假单胞菌致病能力.
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黄芪对铜绿假单胞菌毒力因子调控表达及菌体运动的影响
[目的]观察黄芪对铜绿假单胞菌相关毒力因子表达及菌体运动的影响,探讨黄芪对铜绿假单胞菌的作用机制.[方法]不同浓度黄芪与对数生长期铜绿假单胞菌共培养,弹性蛋白-刚果红降解实验检测细菌分泌的弹性蛋白酶活性,紫外分光光度法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜形成量,在含黄芪琼脂平板中检测菌体集群运动与泳动能力.[结果]黄芪在终浓度25、12.5、6.25 g/L条件下对弹性蛋白酶、绿脓菌素表达有显著抑制,并能抑制生物被膜形成.在低于12.5 g/L时对细菌增殖无显著影响.细菌在12.5 g/L条件下泳动能力与集群运动均受到显著影响.[结论]黄芪对铜绿假单胞菌增殖和毒力因子表达的抑制程度不一致,提示黄芪抑菌可能通过多种途径发挥抑菌功能,并可能在低浓度下便对密度感应系统造成显著抑制.
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鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌群感效应系统影响的研究
目的 研究鱼腥草素钠(SH)对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)群感效应系统的影响,以期探明SH抗PA的作用机制.方法 微量稀释法测定SH和阿奇霉素(AZM)对PA的小抑菌浓度(MIC);紫外分光光度法测定SH对PA LasA蛋白酶活性和绿脓菌素生成的影响;平板法观察PA的形态;半定量PCR法和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测群感效应相关的基因lasI、rhlI、lasR、rhlR、phzM、pqsA、pslA、lasA、lasB、toxA表达量的变化.结果 SH和AZM对PA的MIC分别为512 μg/mL和64 μg/mL;紫外分光光度法结果显示SH能够抑制LasA蛋白酶的活性和绿脓菌素的合成;SH能够显著影响PA的形态;半定量PCR和qRT-PCR结果显示在SH作用下lasI、rhlI、lasR、lasA、pslA、phzM基因表达显著发生变化.结论 SH具有抗PA群感效应属性,通过抑制PA的群感效应系统发挥抗菌作用.
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绿脓菌素在铜绿假单胞菌感染中的作用
绿脓菌素(PCN)是铜绿假单胞菌(PA)产生的一种蓝色的有活性的氧化还原次级代谢产物,其不仅能自由地穿透生物膜、干扰正常离子转运、打断细胞呼吸链、过量产生氧自由基导致细胞死亡,而且容易在PA感染的肺囊性纤维化(CF)患者痰中大量复原.尽管体外研究显示PCN可干扰多种细胞的功能,但其在临床感染中的重要作用尚不明确,因此,本文简要综述有关PCN的新进展以及PCN在PA感染发病机制中的作用.
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S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸对绿脓菌素感染鼠体内的病理形态及氧化作用的影响
目的 探讨S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸(SNAC)对绿脓菌素(PCN)感染鼠体内的病理形态及氧化作用的影响.方法 90只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为3组,每组30只.对照组和PCN组大鼠分别腹腔注射1 ml/100 g 0.9%氯化钠溶液,SNAC组大鼠腹腔注射SNAC(1 ml/100 g).用1%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)行大鼠腹腔注射麻醉,对照组气管内接种0.9%氯化钠溶液0.2 ml,PCN组和SNAC组分别气管内接种PCN 0.2 ml(6×108 CFU/ml).分别于6、18、30、48、72 h观察大鼠一般状态,处死大鼠,取支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,观察肺组织形态学改变,计算BALF细胞总数和中性粒细胞计数,检测活性氧(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、白介素8(IL-8)含量.结果 PCN组鼠感染6 h后出现精神萎靡、食欲不振、寒颤、发热、呼吸困难等,感染30 h时明显;肺组织明显充血、水肿,大量炎性细胞浸润.大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h BALF细胞总数、BALF中性粒细胞计数、ROS含量、SOD活性、IL-8含量比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);其中PCN组和SNAC组各时间点BALF细胞总数、BALF中性粒细胞计数、ROS含量、IL-8含量较对照组均增高,SOD活性较对照组均降低,SNAC组各时间点BALF细胞总数、BALF中性粒细胞计数、ROS含量、IL-8含量较PCN组均降低,SOD活性较PCN组均增高(P＜0.05).结论 SNAC对PCN感染鼠体内氧化损伤具有一定的保护作用.
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氦氧饱和潜水实验人群铜绿假单胞菌鉴定及毒力研究
目的 调查参与某次氦氧饱和实验的潜水作业人群皮肤粘膜日常携带铜绿假单胞菌及其毒力情况.方法 用生化鉴定法对细菌进行分类;稀释平板法分析分离菌株生长特征；分光光度法测定绿脓菌素含量；动物染毒法观察分离菌毒力.结果 27名潜水员中有6名被检出携带铜绿假单胞菌,检出率为22.22％,其生长曲线与对照组铜绿假单胞菌标准株PAO1的生长曲线差异无统计学意义(P＞0.05)；被检出的6株铜绿假单胞菌中有4株绿脓菌素试验为阳性；分离菌株均能造成小鼠致死性感染,绿脓菌素测定为阴性的分离菌株致死率低于绿脓菌素测定为阳性的分离菌株(P＜0.05).结论 在潜水人群中,铜绿假单胞菌广泛存在,在高气压潜水作业过程中极易发生急性感染,应采取必要防控措施.
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N-乙酰半胱氨酸对铜绿假单胞菌的耐药性及绿脓菌素产量的影响
铜绿假单胞菌( pseudomonas aeruginosa )是院内感染的主要病原菌之一,具有很强的耐药性。其产生的次级代谢产物绿脓菌素( pyocyanin,PCN),可改变细胞内氧化还原水平,对宿主造成氧化伤害,是导致铜绿假单胞菌感染病人死亡的主要原因之一[1-3]。 N-乙酰半胱氨酸( N-acetylcysteine, NAC)是一种含有巯基的小分子化合物,常被作为抗氧化剂,用来改善细胞内氧化还原水平[2,4],因此在一些临床实验中,NAC被用来治疗铜绿假单胞菌感染性疾病。但是,从目前已有的研究可以看出, NAC是否有助于铜绿假单胞菌感染性疾病的治疗还没有一致的观点,具体机制也并不清楚。在本研究中,为了进一步明晰NAC与铜绿假单胞菌感染性疾病的关系,我们研究了NAC与铜绿假单胞菌的耐药性和毒性分泌关系。
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铜绿假单胞菌L型的诱导及其产绿脓菌素能力的研究
目的 采用哌拉西林诱导铜绿假单胞菌变异为L型,并研究其L型产绿脓菌素的能力.方法 采用平板纸片法和液体浓度梯度法,利用哌拉西林药物纸片诱导铜绿假单胞菌标准菌株变异为L型;通过绿脓菌素试验测定铜绿假单胞菌L型的绿脓菌素产生能力.结果 铜绿假单胞菌L型可被哌拉西林诱导为L型,铜绿假单胞菌L型仍具有产生绿脓菌素的能力,但产生的速度较原菌慢且量少.结论 铜绿假单胞菌L型为该菌存在的重要形式,其仍能产生绿脓菌素为其致病因素之一.
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绿脓菌素诱导J774细胞氧化损伤及N-乙酰半胱氨酸对其保护作用的实验研究
目的:探讨绿脓菌素(PCN)诱导J774细胞氧化损伤及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对其损伤的保护作用.方法:J774细胞随机分为3个组,(1)正常对照组:未加任何实验药物;(2)模型组:选择不同浓度PCN(10,25,50omg/L)感染J774细胞24 h,结合MTT细胞毒性实验结果,选择佳浓度PCN (25 mg/L);(3)NAC干预组:选择NAC(5 mmol/L)预处理J774细胞1 h,观察NAC对PCN(25 mg/L)感染J774细胞(6,12,24 h)的影响.应用MTT法测定细胞毒性;应用流式细胞术检测活性氧(ROS)的水平;分别应用试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性;应用Western blot方法测定锰超氧化物歧化酶(MnSOD)蛋白表达水平.结果:与正常对照组相比,模型组ROS水平逐渐升高,LDH漏出量增加,MDA含量增加,SOD活性下降,MnSOD蛋白表达逐渐减弱,呈剂量依赖关系;与模型组相比,NAC干预组ROS水平逐渐降低,LDH漏出量减少,MDA含量减少,SOD活性升高,MnSOD蛋白表达逐渐增强,呈时间依赖关系,各组间比较差异均有统计学意义(均P<0.01).结论:PCN可以诱导J774细胞氧化损伤,并呈剂量依赖关系;NAC对PCN诱导J774细胞氧化损伤可能具有保护作用.
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S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸对绿脓菌素感染所致靶器官损伤以及氧化应激的调节作用
目的:研究S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸对绿脓菌素感染所致靶器官损伤以及氧化应激的调节作用.方法:将成年雄性SD大鼠随机分为对照组、NaCl组以及SNAC组,NaCl组和SNAC组均进行气管内绿脓菌素接种,SNAC组给予S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸腹腔注射治疗.比较3组大鼠血清中炎症介质含量以及肺脏组织中凋亡细胞数目、NO含量、氧化反应产物含量、内质网应激标志分子表达量.结果:NaCl组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量以及肺脏组织中凋亡细胞的数目均明显高于对照组,SNAC组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量以及肺脏组织中凋亡细胞的数目均低于NaCl组;NaCl组大鼠肺脏组织中NO的含量均低于对照组,SNAC组大鼠肺脏组织中NO的含量高于NaCl组;NaCl组大鼠肺脏组织中MDA、AOPP、8-OhdG、GRP78的含量均高于对照组,SNAC组大鼠肺脏组织中MDA、AOPP、8-OhdG、GRP78的含量均低于NaCl组.结论:S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸能保护绿脓菌素感染所致肺脏损伤,缓解炎症反应、抑制细胞凋亡、减轻氧化应激反应.
关键词： S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸 绿脓菌素 炎症反应 氧化应激反应 凋亡 -
铜绿假单胞菌对致病真菌的抑制作用
目的：观察临床分离的24株铜绿假单胞菌（PA ）对致病性真菌（如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌等）的抑制作用。方法收集临床上24株PA ，通过革兰染色、氧化酶试验及API 20NE（法国梅里埃公司产品）进行鉴定；通过纸片法、十字交叉划线法及共培养检测PA对致病性真菌的抑制作用。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对有抑制作用的PA和无抑制作用的PA分泌蛋白进行电泳。结果24株PA中部分菌株对常见的致病性真菌有显著抑制作用，而部分PA菌株有一定抑制作用，另外一些完全没有抑制作用；共孵育试验显示 PA可能是通过抑制真菌的菌丝生长而产生抑制作用。SDS-PAGE显示有抑制作用的PA和无抑制作用的PA分泌物蛋白间存在明显差异。结论PA对常见的致病真菌具有抑制作用，推测可能与抑制真菌的菌丝生长及分泌抑制真菌生长的各种蛋白类物质有关。
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PARP抑制剂PJ34在绿脓菌素引起的巨噬细胞损伤中的作用
目的:研究多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制剂PJ34对绿脓菌素(Pyocyanin,PCN)引起的腹腔来源巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用.方法:分别采用800 nM的PJ34预处理细胞2 h(对照组给与0.1％Dimethyl sulfoxide,DMSO)后,不同浓度的PCN(50μM,100μM)刺激24 h,M T T法检测绿脓菌素及PJ34对RAW264.7细胞存活率的影响;采用800 nM的PJ34预处理细胞2 h(对照组给与0.1％DMSO),给与PCN(100μM,3 h)刺激,荧光显微镜及流式细胞术检测细胞内活性氧自由基(Reactive oxi-dant species,ROS)的水平,并采用激光共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞内钙离子水平;或加入18μg·mL-1碳颗粒继续共孵育2 h,显微镜下观察RAW264.7细胞吞噬碳颗粒的情况.结果:PJ34预处理组细胞与单用PCN处理组比较,细胞存活率提高近20％;PJ34预处理缓解了PCN刺激诱导的RAW264.7细胞内ROS和Ca2+水平的升高(P<0.05),并降低了RAW264.7细胞由PCN刺激引起的吞噬功能损伤.结论:PJ34通过抑制PCN引起的RAW264.7细胞内ROS和Ca2+水平升高,提高细胞的存活率并增强细胞的吞噬功能.
关键词： 绿脓菌素 氧化应激 RAW264.7细胞 PJ34 -
乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌毒力因子表达的影响
目的:研究乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌绿脓菌素、弹性蛋白酶表达的影响.方法:在泛耐药铜绿假单胞菌培养基(D600 =0.05)中分别加入乳铁蛋白多肽(LFampin、LFcin)以及乳铁蛋白多肽嵌合体(LFchimera)溶液干预,通过氯仿萃取法定量检测绿脓菌素水平,用刚果红弹性蛋白检测法检测弹性蛋白酶活性.结果:LFampin、LFcin以及LFchimer均对泛耐药铜绿假单胞菌有杀菌活性,且能显著抑制绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达,其作用与浓度呈正相关,其中,LFchimera的作用强于LFampin及LFcin,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:乳铁蛋白多肽,尤其是乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌具有良好的抗菌活性,能显著抑制其绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达.
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维生素E拮抗绿脓菌素抑菌作用的实验研究
目的 通过观察维生素E干预金黄色葡萄球菌的绿脓菌素药敏试验揭示维生素E拮抗绿脓菌素抑菌的作用机制.方法 收集从2011年6月15日～2012年12月15日期间临床微生物标本中分离到的铜绿假单胞菌50株分别编号1～50号和金黄色葡萄球菌3株,分别编号A,B,C.铜绿假单胞菌经内汤培养基增菌后提取绿脓菌素,绿脓菌素与相对应的铜绿假单胞菌编号一致,制备绿脓菌素纸片,每株金黄色葡萄球菌配制菌悬液,分别用相同编号、相同含量的2个绿脓菌素药敏纸片做药敏试验,M-H平板上涂布维生素E的作为试验组,其不涂维生素E的作为相对应的对照组.结果 金黄色葡萄球菌A,B,C各株绿脓菌素纸片抑菌环直径用平均值和标准差(x-±s)表示分别为B实验=16.39±5.12 mm,A实验=19.38±4.38 mm,C实验=21.04±4.72 mm,对照组分别为B对照 =19.33±5.61 mm,A对照=21.30±4.88mm,C对照 =23.18±5.92 mm,试验组抑菌环明显小于对照组.数据经SPSS17.0软件进行成对样本t检验统计,分别为tA=4.240 2,tC=5.266 1,tB=8.153 1,P值均＜0.01.结论 维生素E通过清除绿脓菌素抑菌过程中产生的自由基起到拮抗其抑菌的作用.
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维生素E在绿脓菌素抑菌作用中的研究
目的：通过强抗氧化物维生素E干预绿脓菌素抑制金黄色葡萄球菌过程，研究维生素E能否起到拮抗和减弱绿脓菌素抑菌活性的作用。方法：在金黄色葡萄球菌的绿脓菌素药敏试验中，比较维生素E干预其过程前后抑菌环的变化。结果：维生素E干预后比干预前抑菌环直径明显减小。结论：维生素E作为抗氧化物通过清除过氧化物等自由基起到拮抗绿脓菌素抑菌活性的作用。
