炭疽毒素对免疫细胞特异性影响的研究进展

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰阳性菌,是人兽共患炭疽病的病原体.炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的关键致病因子,是典型的A-B型细菌毒素,其中保护性抗原(protective antigen,PA)是结合亚单位,与靶细胞受体结合;致死因子(lethalfactor,LF)和水肿因子(edema factor,EF)是效应亚单位.

炭疽保护性抗原与炭疽毒素受体结合特征分析

目的:建立检测炭疽毒素保护性抗原(PA)与靶细胞受体(ATR)结合能力的Binding-ELISA方法,并对两者结合特征进行分析.方法:以ELISA实验为基础,建立PA与ATR结合的体外模型,并对实验中的反应条件进行优化.采用Binding-ELISA方法,通过测定不同包被蛋白、不同二价阳离子条件下的D450以及相对饱和度等参数,分析PA与两种ATR的结合特征.结果与结论:以重组PA作为包被抗原时灵敏度更高,包被浓度为2 μg/ml;二价阳离子浓度为5 mmol/L.两种受体与PA的亲和力不同,其中CMG2与PA的结合能力更强;并且两者与PA结合时离子依赖特征不同,PA与TEM8的结合能力在Mn2+存在时强,PA与CMG2的结合能力在Ca2+存在时强.这一结果与国外报道相符,进一步说明Binding-ELISA方法用于定性分析炭疽毒素与其受体结合能力的可行性,为评价以抑制PA与ATR结合为靶点的毒素抑制剂提供了有效的手段.

炭疽保护性抗原第四结构域基因在重组SFV复制子载体中的表达

目的:构建炭疽毒素保护性抗原第四结构域PA4基因的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子载体,并观察PA4抗原在重组SFV复制子载体中的表达.方法:将PA4基因克隆到基于RNA和DNA的SFV复制子表达载体中,获得的重组SFV复制子载体直接转染BHK21细胞,通过间接免疫荧光和Western印迹试验检测PA4在细胞中的表达;与辅助病毒载体共转染制备重组病毒颗粒,通过间接免疫荧光和Western印迹检测PA4在重组病毒颗粒感染细胞中的表达.结果与结论:成功地构建了基于RNA和DNA的PA4重组SFV复制子载体,并且在体外基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体能够在细胞中有效地表达非分泌型和分泌型的PA4抗原,制备了具有感染能力并能表达PA4抗原的重组病毒颗粒,为进一步以SFV复制子作疫苗载体观察炭疽新型复制子疫苗的免疫原性奠定了基础.

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a(+)-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a(+)载体的Trx编码区融合产生pET-32a(+)-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a(+)-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2+金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a(+)-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.

炭疽芽孢杆菌中和性抗体的研究进展

炭疽芽孢杆菌的中和性抗体在炭疽的被动免疫和治疗中有着重要的意义.抗保护性抗原(protective antigen,PA)抗体既能够抑制芽孢出芽又具有中和毒素的作用.抗致死因子(lethal factor,LE)/水肿因子(edema factor,EF)抗体能阻断致死毒素(lethal toxin,LT)/水肿毒素(edema toxin,ET)发挥活性,荚膜抗体能结合补体导致细菌繁殖体裂解.同时中和性抗体的水平也可以作为保护性免疫的评价标准.另一方面中和性单克隆抗体可以作为分析确定PA的中和性表位的有力工具.对中和性表位的分析既有利于探索炭疽毒素致病机制,也可以为现有炭疽疫苗的使用和发展表位疫苗等新型炭疽疫苗提供理论依据.该文综述了炭疽芽孢杆菌中和性抗体的研究进展.

利用细胞毒性实验检测血液中炭疽毒素致死因子的方法学研究

目的 探索利用炭疽毒素致死因子(lethal factor,LF)的细胞毒性检测血液中LF的可行性,为炭疽的临床检测、治疗及相关研究提供支持.方法 利用小鼠巨噬细胞系J774A.1对LF细胞毒性的高度敏感性,检测血液中LF的浓度,对实验条件进行优化,并利用Fischer 344大鼠模型验证该方法的可行性.结果 细胞毒性实验能够检测到血浆中的LF浓度可低至5 ng/ml,该方法操作简单,灵敏度高,并在大鼠模型中得到了验证,利用本法测定LF在大鼠血液中的半衰期为4.8~6.5 h.结论 初步建立了利用细胞毒性实验检测血液中LF的方法,该方法在灵敏性、经济性和实用性等方面具备一定优势,为炭疽相关研究及临床检测提供了新的选择.

obiltoxaximab获FDA批准治疗吸入性炭疽

2016年3月FDA批准了Elusys Therapeutics公司一种新的吸入性炭疽治疗药物obiltoxaximab（Anthim）。该药是一种单克隆抗体，与炭疽杆菌（anthrax）产生的毒素结合，抑制毒素与细胞受体的结合，阻止细胞内炭疽致死因子和水肿因子、炭疽毒素的致病作用。其作用机制尚不清楚。与适当的抗菌药联用，可用于成人和儿童的吸入性炭疽热的治疗。该药也可用于预防吸入性炭疽热。治疗前采用苯海拉明预治疗，静脉输注前用生理盐水稀释，输液时间＞90 min。成人推荐剂量为16 mg/kg，体质量＜40 kg者参阅说明书；儿童体质量＞40 kg剂量为6 mg/kg，15～40 kg为24 mg/kg，≤15kg为32 mg/kg。

炭疽毒素小分子抑制剂

炭疽病是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的恶性传染病,炭疽菌进入宿主后产生的炭疽毒素是感染者致死的主要原因.炭疽毒素含有2种具有酶催化活性的蛋白质——致死因子和水肿因子,以及1种共同的结合和转运蛋白质——炭疽保护性抗原,炭疽保护性抗原分别与上述两种因子组成致死毒素和水肿毒素.现阶段治疗炭疽病的主要药物为抗生素,但抗生素只能杀灭人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌,不能抵抗孢子和细菌在体内产生的毒素,因而需要开发抑制炭疽毒素的新型药物.本文主要综述近年来国际上对靶向保护性抗原、致死因子和水肿因子的炭疽毒素小分子抑制剂的主要研究进展.

炭疽毒素受体CMG2胞外区的截短表达、纯化及鉴定分析

[目的]分析CMG2胞外区的分子结构与功能,探讨ATR与PA结合的活性位点及特征,为阐明炭疽毒素的致病机理提供依据.[方法]用pQE30表达质粒在大肠杆菌内表达长短不同的3个CMG2胞外区截短片段,经纯化后,用Western blotting和细胞保护性实验对3个重组蛋白进行分析.[结果]发现3个重组蛋白均可与485单抗结合,但均没有细胞保护活性.[结论]3个截短蛋白失去了与PA结合的能力,说明CMG2的187～217之间氨基酸残基对PA结合很重要,不可或缺.

炭疽毒素受体单克隆抗体的制备、鉴定及结合位点分析

[目的]制备与鉴定针对两种炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,ATR)的特异性单克隆抗体,为建立ATR的检测方法、研究炭疽毒素的致病机理提供工具.[方法]以重组表达的两种ATR即毛细血管形态发生蛋白2(capkllary morphogenesis protein 2,CMG2)和肿瘤内皮标志8蛋白(tumor endothelial marker 8,TEM8)分别免疫小鼠,制备单克隆抗体,用ELISA、Western dot blotting及细胞保护性试验等方法对所制备的单克隆抗体进行鉴定和分析,并尝试应用上述单克隆抗体经双抗体夹心ELISA、Western blotting和IFA对ATR进行检测.[结果]获得针对CMG2的单克隆抗体485、4G3;针对TEM8的单克隆抗体2D6、489;以及可同时结合CMG2和TEM8的单克隆抗体2G4,其中485具有一定的细胞保护活性,这些单克隆抗体可用于ATR的特异性检测.[结论]本研究所制备的单克隆抗体可经ELISA、Western blotting和IFA用于ATR体内外检测,从而为探讨炭疽毒素的致病机理提供有效的研究手段.

CMG2-Fc融合蛋白突变体筛选及中和炭疽毒素活性分析

目的:筛选能有效中和炭疽毒素和抵抗炭疽毒素损伤细胞的CMG2-Fc(炭疽毒素受体Ⅱ-人免疫球蛋白Fc段融合蛋白)突变体.方法:运用FoldX等计算软件分析CMG2与PA晶体学结构,设计能提高CMG2-PA亲和力的突变体分子,并与人IgG1 Fc片段构成融合基因,转染CHO-S细胞并通过亲和层析获得CMG2-Fc突变体蛋白,通过亲和力检测和细胞保护实验分析各突变体中和炭疽毒素能力.结果:筛选并表达了8个CMG2-Fc突变体分子,亲和力实验显示其中E117Q突变可明显提高CMG2-Fc与PA的亲和力(KD=1.35× 10-11 mol/L),细胞保护实验提示E117Q突变能有效提高CMG2-Fc中和炭疽毒素能力(CMG2-Fc(E117Q)的IC50为15 ng/μL,而wtCMG2-Fc的IC50为50 ng/μL).结论:CMG2-Fc(E 117Q)突变体分子可作为拮抗炭疽毒素损伤的炭疽治疗药物分子,进行进一步研究.

炭疽受体CMG2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力.方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测 CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力.结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤.结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染.

炭疽毒素受体结构和功能研究进展

肿瘤血管内皮标志物8(TEMS)和毛细血管形态发生蛋白2(CMG2)是已知的两个炭疽毒素受体,它们的主要功能是当炭疽杆菌侵染细胞时介导炭疽毒素进入宿主细胞.这两个受体都是涉及到细胞外基质动态平衡的I型跨膜蛋白,并且都因为它们在血管生成或血管内皮细胞中表达增强而被发现.有研究发现TEM8能够调节内皮细胞迁移和血管形成,而CMG2则在内皮细胞增殖过程中起重要作用.进一步的研究显示它们与整联蛋白同源性较高,但它们确切的生理功能和作用机制尚不明确.本文中,主要讨论这两种蛋白的结构和它们作为炭疽毒素受体介导炭疽毒素进入细胞的分子机制,然后我们简单探讨一下TEM8在靶向肿瘤血管内皮细胞的抗血管生成和抗肿瘤疗法方面的研究进展,后我们展望了下一步炭疽毒素受体研究的热点-它们的配体及生理功能研究.

049 炭疽毒素亚单位的显性失活突变体是治疗炭疽的一种新方法

抗炭疽毒素药物研究近展

炭疽毒素抑制剂试验

LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究

目的: 表达融合蛋白LFn-MAGE3, 探讨无毒炭疽毒素用于治疗肿瘤的可能性.方法: 将LFn的编码序列导入PET21a表达载体中, 构建LFn融合表达载体PET21a-LFn.将全长MAGE-3基因插LFn融合表达载体中, 构建了PET21a-LFn-MAGE3融合蛋白表达载体.将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中, 诱导表达LFn-MAGE3融合蛋白.表达产物用Q sepharose FF离子交换柱和Phe HP疏水柱进行纯化.LF毒性抑制实验和细胞免疫荧光实验检测融合蛋白的生物学活性.结果: 融合蛋白LFn-MAGE3在大肠杆菌BL21a获得胞内可溶性表达, 经纯化后, 获得一定纯度的LFn-MAGE3融合蛋白.细胞免疫荧光实验显示LFn-MAGE3能在PA(炭疽保护性抗原)协同下高效进入巨噬细胞.结论: 表达纯化获得的LFn-MAGE3融合蛋白能在PA协助高效进入细胞, 可以用于下一步的肿瘤免疫治疗的动物实验中.