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RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响
目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性(P﹤0.05).结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.
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小鼠胃癌MAGE3抗原H-2Kk限制性抗原肽的筛选
本研究对小鼠胃癌MAGE3抗原H-2Kk限制性的抗原肽进行了筛选.用CTL表位预测的基序法对易与H-2Kk结合的多肽序列进行了预测并人工合成了4个多肽.在体外检测了各多肽刺激H-2Kk型小鼠T细胞增殖和分泌IFN-γ的能力,同时测定了各多肽诱导出的CTL对小鼠前胃癌细胞株MFC细胞的杀伤活性.结果显示,抗原肽MAGE3130-137可有效地刺激特异性T细胞的增殖和分泌细胞因子IFN-γ,其诱导出的CTL细胞对MFC细胞也有较高的杀伤活性.这些实验结果证实抗原肽MAGE313o-137可以作为多肽疫苗来对表达MAGE3抗原的H-2Kk型小鼠胃癌进行免疫治疗.
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MAGE3 siRNA表达载体的构建及其沉寂作用
目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对MAGE3基因的干扰作用.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER.neo载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染胃癌细胞BGC823,采用RT-PCR检测MAGE3基因mRNA表达水平的变化.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER.neo载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;稳定转染人胃癌细胞BGC823后,RT-PCR检测显示,MAGE3基因的表达水平明显降低.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制MAGE3基因表达.
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LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究
目的: 表达融合蛋白LFn-MAGE3, 探讨无毒炭疽毒素用于治疗肿瘤的可能性.方法: 将LFn的编码序列导入PET21a表达载体中, 构建LFn融合表达载体PET21a-LFn.将全长MAGE-3基因插LFn融合表达载体中, 构建了PET21a-LFn-MAGE3融合蛋白表达载体.将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中, 诱导表达LFn-MAGE3融合蛋白.表达产物用Q sepharose FF离子交换柱和Phe HP疏水柱进行纯化.LF毒性抑制实验和细胞免疫荧光实验检测融合蛋白的生物学活性.结果: 融合蛋白LFn-MAGE3在大肠杆菌BL21a获得胞内可溶性表达, 经纯化后, 获得一定纯度的LFn-MAGE3融合蛋白.细胞免疫荧光实验显示LFn-MAGE3能在PA(炭疽保护性抗原)协同下高效进入巨噬细胞.结论: 表达纯化获得的LFn-MAGE3融合蛋白能在PA协助高效进入细胞, 可以用于下一步的肿瘤免疫治疗的动物实验中.
