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非病毒载体H1s-EGFc的构建及其功能的初步研究
目的探讨和构建一种用于靶向性基因治疗的非病毒载体.方法采用基因工程的方法构建H1s-EGFc融合蛋白表达载体,在毕赤酵母表达系统中获得分泌表达的融合蛋白.使用阴离子交换柱及分子筛进行纯化.制备H1s-EGFc融合蛋白与pKG杀伤基因表达重组体的复合物.选用表皮生长因子受体高表达的HeLa细胞及表皮生长因子受体不表达的Jurkat细胞进行复合物特异性杀伤活性测试. 结果构建并表达了H1s-EGFc融合蛋白,所获融合蛋白纯度可达90%以上.该融合蛋白能够有效地包装杀伤基因表达载体,将其导入表皮生长因子受体特异性表达的肿瘤细胞中,达到靶向性杀伤作用,当融合蛋白/杀伤基因复合物使用剂量分别是3、6、9 μg/ml时,杀伤率分别为30.6%、36.2%和58.1%;而对表皮生长因子受体不表达的细胞无杀伤作用.结论融合蛋白H1s-EGFc能够有效地用于功能基因的包装及转运,可以作为非病毒载体应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗.
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白血病细胞来源微粒BCR-ABL mRNA检测在监测慢性髓性白血病治疗反应中的意义
目的 探讨通过检测白血病细胞来源微粒(MP)BCR-ABL融合基因水平对达完全分子学反应(CMR)后慢性髓性白血病(CML)患者进行分层的可能.方法 收集29例不同疾病状态的CML患者,采用实时定量PCR方法分别检测患者外周血细胞与MP中的BCR-ABL mRNA水平.结果 患者外周血MP和细胞中均能稳定检测出BCR-ABL mRNA；CMR、主要分子学反应(MMR)、完全细胞遗传学反应(CCyR)三种疾病状态下患者MP中的BCR-ABL mRNA水平分别为9.1±2.8、25.2±6.9和62.8±6.3,差异具有统计学意义(P＜0.05)；细胞内BCR-ABL转录本为阴性时,来源于同一份样本的MP仍可检测到BCR-ABL mRNA[中位水平6.5(3.7～15.3)]；CMR患者MP中BCR-ABL融合基因水平与服药时间呈负相关(t=-0.656,P＜0.05)；在同样达到CMR的前提下,造血干细胞移植组患者和酪氨酸激酶抑制剂治疗组患者相比,MP中BCR-ABL mRNA水平更低(分别为3.3±2.1和9.1±2.8,P＜0.05).结论 CML患者外周血细胞来源MP中可以稳定检出BCR-ABL mRNA,并有望成为患者达CMR后继续监测的重要指标.
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热休克蛋白90抑制剂17-AAG诱导K562细胞凋亡作用的研究
目的 研究热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂17-AAG诱导人白血病细胞系K562细胞凋亡及其分子机制.方法 用17-AAG处理K562细胞,用四氮唑盐还原法(MTT法)检测17-AAG对K562细胞增殖抑制的剂量-时间-效应关系,瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态学变化,Hoechst 33342荧光染色观察凋亡细胞核的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化,Western blot检测相关蛋白分子的变化.结果 17-AAG呈时间和剂量依赖性抑制K562细胞,5 μmol/L17-AAG作用24 h,K562细胞增殖抑制率接近50%,阻断细胞周期于G0/G1期.5μmol/L 17-AAG作用12 h G0/G1期细胞占47.22%;24 h占71.62%,并出现明显的凋亡峰.17-AAG可有效清除Hsp90底物蛋白,阻断Raf/MekErk及PI3K/Akt信号通路.结论 17-AAG通过抑制K562细胞中Hsp90的分子伴侣功能,清除其底物蛋白Bcr-Abl、Raf-1、Akt、Cdk4、XIAP、survivin等,导致细胞内与增殖和抗凋亡相关的Raf/Mek-Erk、PI3K/Akt信号通路被阻断,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.
关键词： 热休克蛋白90抑制剂 细胞凋亡 融合蛋白类 BCR-ABL K562细胞 -
实时定量RT-PCR方法监测急性髓系白血病患者造血干细胞移植后AML1-ETO融合基因mRNA水平的临床意义
目的 评价实时定量RT-PCR(Q-PCR)方法监测AML1-ETO(+)急性髓系白血病(AML)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后AML1-ETO mRNA水平的表达及其临床意义.方法 采用基于TagMan探针的Q-PCR技术检测17例AML1-ETO(+)AML患者allo-HSCT后不同时间骨髓标本AML1-ETO mRNA的表达.AML1-ETO mRNA水平以内参基因abl进行归一化.采用荧光原位杂交(FISH)法评估HSCT后是否达到细胞遗传学完全缓解(CCyR).结果 Q-PCR实验可重复敏感度为5个拷贝.在16例CCyR患者中,1例死于移植物抗宿主病(GVHD),1例死于感染,其余14例中位随访时间为268(70～811)d,HSCT后1个月(+1月)AML1-ETO中位水平0(0～0.740),+2月为0.026(0～2.900),+3月为0.039(0～3.300).移植时间超过12个月的5例患者中,中位随访685(385～811)d,4例仍呈AML1-ETO阳性,中位值0.078(0.003～0.120).1例复发患者+1月为0,+2月为9.800,+3月为5.600,+110 d血液学复发,AML1-ETO mRNA为390.000,+382 d死亡.结论 1年内AML1-ETO持续低水平阳性不一定预示复发;对AML1-ETO(+)AML患者HSCT后定期动态监测AML1-ETO水平十分必要.
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伴有t(3;5)(q25;q34)的骨髓增生异常综合征急性髓系白血病变患者的分子特征
目的 研究t(3;5)(q25;q34)的分子特征.方法 R显带染色体核型分析和染色体涂染分析确定t(3;5)(q25;q34)存在.RT-PCR法检测患者NPM-MLF1融合基因、MLF1基因表达.PCR联合序列分析检测NPM基因突变.实时定量RT-PCR(Real-time PCR)检测Evi-1,MDS1/Evi-1表达.免疫组化染色确定MLF1和NPM-MLF1蛋白细胞定位分布.Western blot法检测bcl-2蛋白表达.结果 染色体核型分析和涂染分析均证实存在染色体t(3;5)(q25;q34),NPM-MLF1融合基因阳性,经诱导治疗获得完全缓解后转为阴性.患者白血病细胞仅表达MLF1基因非编码蛋白剪接体,不表达Evi-1基因,弱表达MDS1/Evi-1.无NPM基因突变,未检出bcl-2蛋白表达.MLF1蛋白定位于细胞质,而NPM-MLF1则主要定位于胞核.结论 t(3;5)(q25;q34)是髓系肿瘤的一种少见的染色体易位,该染色体易位导致形成NPM-MLF1融合基因是其发病的分子学基础.
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RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用
目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl融合基因表达的抑制作用.方法体外化学合成针对bcr/abl融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株,以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照;同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照,流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率;实时定量RT-PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应.MTF法检测细胞增殖抑制率.膜联蛋白Ⅴ(An-nexin Ⅴ)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率.结果电穿孔的转染效率可达70%;化学合成的siRNA可以抑制bcr/abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;特异性siRNA可以抑制细胞增殖,转染24 h细胞增殖抑制率达47%,48 h达56%;特异性siRNA转染细胞24 h组凋亡率为15.05%,48 h组为19.47%,与对照组(1.00%)比较明显提高.结论在细胞水平上,化学合成的siRNA可以抑制bcr/abl融合基因的表达,为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础.
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人细胞骨架调节蛋白基因Nelin N端片段的原核表达
[目的]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白.[方法]设计带有BamH I/EcoR I酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEX-5X-Nelin为模板,用PCR扩增Nelin基因N端片段,并用BamH I/EcoR I酶切PCR产物和原核表达载体pGEX-5X-1,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒pGEX-5X-Nelin-1,经双酶切鉴定和测序验证.重组表达质粒转化大肠杆菌BL 21,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,以SDS-PAGE进行分析.[结果]成功构建并表达了分子量约为43 KD的Nelin N端片段的融合蛋白.[结论]所表达的蛋白为蛋白纯化、抗体制备及研究其功能奠定了基础.
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早幼粒白血病-维甲酸受体α融合蛋白对RIAM基因转录的负调控作用探讨
目的:研究异常转录因子早幼粒白血病-维甲酸受体α(promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor alpha,PML-RARα)融合蛋白对RIAM基因的转录调控机制.方法:利用表达谱数据库(GSE1159)比较RIAM基因在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)各亚型中的表达情况,以及RIAM基因和PML-RARα融合蛋白之间的相关性.采用蛋白质印迹法和实时荧光定量-PCR法分别检测PML-RARα融合蛋白和RIAM基因在急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)模式细胞株PR9及APL患者来源的细胞株NB4中的表达情况,以及在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)处理前后的RIAM mRNA的表达情况.利用染色质免疫沉淀技术检测细胞内PML-RARα融合蛋白在RIAM基因启动子附近的结合情况.结果:RIAM基因在APL(即M3型AML)中的表达水平明显低于其他AML亚型(M0、M1、M2、M4、M5和M7型)和正常造血细胞(P＜0.05).随着PML-RARα融合蛋白的表达,RIAM基因的表达水平明显降低.ATRA能激活RIAM基因的表达,且PML-RARα融合蛋白的表达能增强ATRA对RIAM基因表达的激活效应.PML-RARα融合蛋白结合在RIAM基因的启动子区域.结论:RIAM基因是PML-RARα融合蛋白的靶基因,PML-RARα融合蛋白通过结合到RIAM基因的启动子区域对其转录进行负调控.
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PTD-OD-HA融合蛋白对bcr/abl阳性细胞凋亡的影响
目的:研究含有蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)、寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)和HA标签的PTD-OD-HA融合蛋白对几种bcr/abl阳性细胞株细胞凋亡的影响.方法:将前期制备的PTD-OD-HA蛋白作用于几种bcr/abl阳性细胞后,应用FCM法、DNA 梯度电泳(DNA ladder)和透射电子显微镜检测细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因bax、bcl-2的mRNA和蛋白水平变化.结果:FCM法检测发现,PTD-OD-HA能促进bcr/abl阳性细胞发生凋亡;DNA ladder实验检测发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210和K562细胞DNA电泳有梯状条带;透射电子显微镜观察发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210细胞发生了凋亡;RT-PCR及Western印迹法检测显示,促凋亡基因bax的mRNA及蛋白水平增高,抗凋亡基因bcl-2的mRNA及蛋白水平降低.结论:PTD-OD-HA蛋白可以特异性诱发bcr/abl阳性细胞的凋亡.
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伊马替尼对儿童急性淋巴细胞白血病的疗效
目的 观察伊马替尼对BCR?ABL融合基因阳性儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的疗效.方法 回顾性分析10例BCR?ABL P?190融合基因阳性ALL患儿的临床特点及治疗.结果 10例患儿中,平均发病年龄(9.60±2.97)岁,均为B-细胞性ALL,7例(70%)治疗第19天骨髓完全缓解,9例(90%)治疗第35天骨髓完全缓解,9例(90%)患儿体内微小残留病变持续转阴,7例(70%)BCR?ABL P190融合基因持续阴性,2例(20%)BCR?ABL P190融合基因持续阳性.结论 对BCR?ABL融合基因阳性的ALL患儿,在化疗的基础上及早加用伊马替尼可明显提高缓解率.
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塞来昔布联合三氧化二砷对慢性粒细胞白血病原代细胞bcr-abl蛋白及信号转导的影响
目的 探讨塞来昔布联合三氧化二砷( As2O3)对慢性粒细胞白血病(CML)原代细胞bcr-abl融合基因mRNA表达、bcr-abl蛋白即p210蛋白表达、蛋白质酪氨激酶(PTK)活性以及对下游增殖信号转导途径的影响.方法 用塞来昔布(40 μmol/L)、As2O3(2μmol/L)单独以及二者联合干预CML患者骨髓单个核细胞36 h,进行实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)、Western印迹和PTK活性检测,分析bcr-abl融合基因mRNA的表达、p210蛋白表达以及PTK活性的变化,以Western印迹检测STAT1、STAT5、磷酸化STAT1( p-STAT1)、磷酸化STAT5( p-STAT5)以及ID1的表达变化.结果 RQ-RT-PCR结果显示,对照组、塞来昔布组、As2O3组和塞来昔布联合As2O3组的mRNA水平分别为(5.97±0.53)％、(5.74±0.46)％、(5.94±0.57)％和(3.06±0.41)％,仅塞来昔布联合As2O3组与对照组的比较差异有统计学意义(t=28.35,P=0.00).p210蛋白表达量化分析显示,塞来昔布与As2O3均可下调p210蛋白,而塞来昔布联合As2O3则显著下调p210蛋白.PTK活性检测显示,对照组、塞来昔布组、As2O3组和塞来昔布联合As2O3组吸光度(A450)值分别为1.17±0.11、1.14±0.19、1.16±0.21和0.83±0.15,塞来昔布联合As2O3组与对照组比较差异有统计学意义(t=4.38,P=0.04).Westem印迹检测显示,塞来昔布联合As2O3可更显著下调STAT1、STAT5、p-STAT1、p-STAT5和ID1蛋白表达.结论 塞来昔布联合As2O3对下调CML原代细胞bcr-abl mRNA和蛋白表达、抑制PTK活性、抑制STAT及ID1信号转导通路具有协同作用.
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bcr-abl阴性骨髓增生性疾病患者JAK2V617F点突变检测的临床意义
目的 探索Janus Kinase 2V617F基因突变(JAK2V617F)在bcr-abl阴性骨髓增生性疾病(MPD)的发生率和临床意义.方法 基因组DNA从患者骨髓或外周血粒细胞中提取.采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)、限制性内切酶消化和PCR产物测序的方法检测JAK2V617F突变.共检测患者110例,其中bcr-abl阴性MPD 41例、bcr-abl阳性慢性粒细胞白血病(CML)25例和急性白血病44例.结果 JAK2V617F阳性结果分别为真性红细胞增多症(PV)11例(91.7%)、原发性血小板增多症(ET)8例(53.3%)、特发性骨髓纤维化(IMF)4例(57.1%),而高嗜酸粒细胞增多症(HES)7例、bcr-abl阳性CML 25例和急性白血病44例[包括急性髓细胞白血病(AML)24例、急性淋巴细胞白血病(ALL)18例、急性混合细胞白血病2例1均未检测到JAK2V617F基因突变.在所有JAK2V617F阳性的标本和10份阴性标本中,AS-PCR和限制性内切酶消化方法的测定结果都可经测序进一步证实.结论 90%以上的PV、50%以上的ET和IMF可检测到JAK2V617F基因突变;JAK2V617F基因突变在PV、ET和IMF的诊断和鉴别诊断中有重要意义,可以作为诊断的分子标志,也可能是治疗的新靶点.
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Ph-bcr-abl+血液病的间期荧光原位杂交检测
目的 探讨间期荧光原位杂交(FISH)技术在检测Ph-bcr-abl+血液病患者中的作用.方法 应用bcr-abl双色探针双融合荧光原位杂交(D-FISH)技术对7例常规细胞遗传学(CC)检测Ph-或不肯定而巢式反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测bcr-abl+的血液病患者进行DNA水平的bcr-abl融合基因检测.结果 例2 FISH检测第一次bcr-abl+细胞占13.5%,第二次bcr-abl+细胞占11.5%.例4和例6分别检出1%的bcr-abl+细胞,略高于正常分界值.例7检出0.5%的bcr-abl+细胞,其余患者未检出bcr-abl+细胞.结论 Ph-bcr-abl+血液病患者DNA水平存在低水平的bcr-abl+细胞;FISH有助于Ph-或不确定以及bcr或abl断裂点不在通常位点的bcr-abl+细胞的检出.
