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PML-RARα融合基因及其诱导特异性免疫应答
PML-RARα融合基因通过其转录抑制作用而诱发APL已基本得到认可,但其引发APL的机制是错综复杂的,在PML-RARα融合基因的致病过程中,必须有其他因素的共同参与才能导致APL.同时PML-RARα融合蛋白上存在着抗原性,PML-RARα多肽可诱导特异性免疫应答,为免疫治疗的研究提供了可能性.
关键词： PML-RARα 急性早幼粒细胞白血病 基因疫苗 克隆性 -
PML-RARα及p21是维持急性早幼粒细胞白血病干/祖细胞生存的关键因素
肿瘤干/祖细胞是肿瘤组织内具有自我更新、分化成为肿瘤组织内所有细胞群体及持续增殖能力的起始细胞,被认为是肿瘤复发、耐药以及转移的根源.急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)作为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一个亚型,因全反式维甲酸和砷剂治疗对其具有良好效果而成为肿瘤靶向治疗的典范.本文通过总结近期关于APL干/祖细胞的研究,说明APL内可能存在着两群APL干/祖细胞,而APL干/祖细胞可能依赖于致癌PML-RARα融合蛋白、细胞周期抑制物p21、自我更新相关的分子以及趋化因子等维持其自我更新及生存,而全反式维甲酸及砷剂主要是通过降解PML-RARα融合蛋白、激活FOXO3A、抑制自我更新相关信号通路Shh的活化而达到清除APL于/祖细胞的效应,这对于指导其他肿瘤的治疗有重要意义.
关键词： PML-RARα p21 急性早幼粒细胞白血病 白血病干/祖细胞 -
PML-RARα对BHLHB2基因转录调控的影响
本研究探讨异常转录因子PML-RARα对BHLHB2基因的转录调控机制,进一步揭示急性早幼粒细胞性白血病(APL)的致病机理.利用RT-PCR技术研究PML-RARα融合蛋白及ATRA在APL模式细胞株PR9和APL病人来源的NB4细胞中对BHLHB2转录的影响;利用ChIP-PCR技术探讨PML-RARα在体内调控BHLHB2转录的作用方式;通过分析病人样本数据,观察BHLHB2在各种急性髓系白血病(AML)中的表达情况.结果表明,随着PML-RARα融合蛋白的表达升高BHLHB2的转录受到明显抑制,并且无论在APL模式细胞株PR9还是APL病人来源的N4细胞中,ATRA均能够解除这种抑制,诱导BHLHB2的表达上调;而在不表达PML-RARα的U937细胞株中,ATRA不能诱导BHLHB2的表达上调.研究结果提示,PML-RARα通过结合于BHLHB2的启动子区域抑制其转录.与其他类型的AML和正常的骨髓细胞相比声HLHB2在APL中表达较低.结论:BHLHB2是PML-RARα的靶基因,PML-RARα通过与其启动子区域结合对其转录进行负调控.
关键词： PML-RARα BHLHB2 转录调控 急性早幼粒细胞白血病 -
PML-RARα系列重组质粒在BALB/c小鼠体内表达分析
目的 检测PML-RARα融合基因疫苗在小鼠体内的转录和表达.方法 用成功构建的重组质粒(PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠,于第0周、2周、4周在双侧股四头肌各注射1次,分离注射部位肌肉,用RT-PCR检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录;应用免疫组织化学染色法检测重组质粒蛋白表达.结果 小鼠注射部位肌肉中检测到PML-RARα及hIL-2基因的转录.并可检测到hIL-2蛋白的表达.结论 所构建的PML-RARα系列重组质粒可以在小鼠体内有效地表达基因产物,具有DNA疫苗的基本特性.
关键词： PML-RARα hIL-2 急性早幼粒细胞白血病 DNA疫苗 -
PML-RARα-hIL2 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后胸腺初始T细胞水平变化
目的 了解PML-RARα-hIL-2基因疫苗免疫小鼠后胸腺初始(na(I)ve)T细胞变化情况.方法 利用实时定量PCR检测小鼠胸腺组织DNA中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的水平,从而评价小鼠胸腺中na(I)ve T细胞含量.结果 利用PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫小鼠后胸腺中所含的TRECs拷贝数明显高于单个基因疫苗PML-RARα或hIL-2组及对照组.结论 所构建的PML-RARα-hIL-2双表达质粒可诱导小鼠胸腺产生na(I)ve T细胞数量增加,可能与产生更强的细胞免疫应答有关.
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PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的细胞和体液免疫应答
目的 分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况.方法 用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后,分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARa抗体.结果 免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组.结论 所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答.
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急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因实时定量RT-PCR标化法和常规法计算的比较
目的 改进实时定量RT-PCR的检测计算方法,提高定量RT-PCR在急性早幼粒细胞白血病(APL)微量残留病变监测的临床应用价值.方法 采用实时定量RT-PCR和常规定性RT-PCR检测31例APL患者在治疗前后融合基因PML-RARα的表达水平,对两种计算方法进行比较:常规按照患者治疗前后自身比较计算(常规法)和治疗前标准化基线水平计算(标化法).结果31例患者采用两种定量计算方法结果近似,标化法计算结果示患者在治疗缓解、巩固治疗和维持治疗期间融合基因PML-RARα转录本对数下降值分别为(2.0±1.9)、(4.9±1.4)和(5.7±0.1),常规法计算结果为(1.9±1.9)、(4.8±1.3)和(5.7±0.4).在维持治疗阶段标化法定量RT-PCR的结果显示患者个体差异更小.按照标化法计算结果,次要分子生物反应(对数值≥3)和主要分子生物反应(对数值≥5)标准仍然适用.结论 采用标化法计算实时定量RT-PCR结果能较好的对APL患者的微量残留病变进行监测,一定程度上降低了患者个体差异对检测结果的影响,同时适用于治疗前标本缺如的患者.
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急性早幼粒细胞白血病中国诊疗指南(2011年版)
第一部分初诊患者入院检查、诊断一、病史采集及重要体征1.年龄;2.此前有无血液病史(主要指骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤等);3.是否为治疗相关性(包括放疗、化疗);4.有无重要脏器功能不全(主要指心、肝、肾功能).二、实验室检查1.血常规、血生化、出凝血检查;2.骨髓细胞形态学(包括细胞形态学、细胞化学、组织病理学);3.细胞遗传学检测:t(15;17)染色体异常;4.分子学检测:PML-RARα(或少见的PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM-RARα、Stsb5-RARα)融合基因、FLT3-ITD基因突变;5.免疫分型.
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pIRES-PML-RARα-IFN-γ重组质粒体外表达检测
目的:检测pIRES-PML-RARα-IFN-γ重组质粒在真核细胞中的表达情况,为急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的研发提供资料.方法:将构建成功的pIRES-PML-RARα-IFN-γ重组质粒转染A549细胞株,提取总RNA,逆转录合成cDNA,采用RT-PCR法检测PML-RARα和IFN-γ基因的表达情况.提取转染后A549细胞的上清液采用Western blot和ELISA法检测PML-RARα和IFN-γ蛋白的表达情况.结果:RT-PCR结果证明转染了重组质粒的A549细胞的cDNA中含有相应的目的基因.ELISA和Western blot结果表明,重组质粒能够在A549细胞中表达出相应的目的蛋白.结论:pIRES-PML-RARα-IFN-γ重组质粒能够在真核细胞中进行正常的转录及翻译.
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PML-RARα和IFN-γ重组载体的构建
目的:构建PML-RARα融合基因与人干扰素γ(IFN-γ)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)奠定基础.方法:利用PCR技术从APL细胞株(NB4细胞)的RNA中扩增出PML-RARα的部分基因片段,从含有IFN-γ基因的质粒中通过PCR扩增出IFN-γ基因,利用基因克隆技术将PML-RARα和IFN-γ基因片段克隆到Pires质粒中,然后利用双酶切和序列分析方法验证所构建真核双表达载体的正确性.结果:双酶切结果证明重组载体中含有相应大小的PML-RARα基因片段及IFN-γ基因片段,且序列分析证明重组载体中插入片段的碱基序列均完全正确.结论:构建了含有PML-RARα基因及IFN-γ基因的真核双表达载体,为下一步验证蛋白的表达及DNA疫苗的研制奠定基础.
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早幼粒白血病-维甲酸受体α融合蛋白对RIAM基因转录的负调控作用探讨
目的:研究异常转录因子早幼粒白血病-维甲酸受体α(promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor alpha,PML-RARα)融合蛋白对RIAM基因的转录调控机制.方法:利用表达谱数据库(GSE1159)比较RIAM基因在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)各亚型中的表达情况,以及RIAM基因和PML-RARα融合蛋白之间的相关性.采用蛋白质印迹法和实时荧光定量-PCR法分别检测PML-RARα融合蛋白和RIAM基因在急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)模式细胞株PR9及APL患者来源的细胞株NB4中的表达情况,以及在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)处理前后的RIAM mRNA的表达情况.利用染色质免疫沉淀技术检测细胞内PML-RARα融合蛋白在RIAM基因启动子附近的结合情况.结果:RIAM基因在APL(即M3型AML)中的表达水平明显低于其他AML亚型(M0、M1、M2、M4、M5和M7型)和正常造血细胞(P＜0.05).随着PML-RARα融合蛋白的表达,RIAM基因的表达水平明显降低.ATRA能激活RIAM基因的表达,且PML-RARα融合蛋白的表达能增强ATRA对RIAM基因表达的激活效应.PML-RARα融合蛋白结合在RIAM基因的启动子区域.结论:RIAM基因是PML-RARα融合蛋白的靶基因,PML-RARα融合蛋白通过结合到RIAM基因的启动子区域对其转录进行负调控.
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Hsp90抑制剂HDN-1诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞凋亡的研究
目的 探讨南极土壤来源真菌的次级代谢产物HDN-1对人急性粒细胞白血病Nt4细胞的增殖抑制,诱导凋亡作用及其机制.方法 采用MTT法检测HDN-1对NB4细胞的增殖抑制作用;DNA结合染料Hoechst 33324染色,Western Blot实验,流式细胞仪检测细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的变化.结果 HDN-1能显著抑制NB4细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性;HDN-1作用后,细胞核形态发生明显变化且流式细胞仪分析表明NB4细胞凋亡数量明显增加;HDN-1可引起Caspase-3,8,9激活,bid减少,线粒体中凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1的表达降低,以及γ-H2AX、Parp剪切带增加.但是NB4细胞中融合蛋白PML-RARα的表达不能被HDN-1所抑制.结论 HDN-1诱导凋亡是通过Caspase依赖的线粒体途径和死亡受体途径共同介导的,PML-RARα不是Hsp90的客户蛋白,其诱导凋亡机制可能是通过抑制Hsp90的其他蛋白表达进行的.
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动态监测PML-RARα融合基因对急性早幼粒细胞白血病的临床意义
目的 动态监测急性早幼粒细胞白血病(APL)特有的PML-RARα基因,并探讨其临床意义.方法 15例APL患者用全反式维甲酸(ATRA)和其他化疗药物进行诱导缓解、巩固和维持治疗,并进行随访,在病程的不同阶段采集骨髓标本进行形态学检查,并采用实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测PML-RARα基因表达.结果 15例APL患者入院时PML-RARα均为阳性,治疗中死亡1例、完全缓解14例(93%).14例完全缓解患者中2例复发,13例在病程中PML-RARα转为阴性.2例复发患者中,1例PML-RARα持续阳性,1例在病程中由阴性转为阳性.13例仍生存者中,至少已连续3次PML-RARα为阴性.结论 对APL患者跟踪检测PML-RARα融合基因可早期发现复发病例;RQ-PCR检测PML-RARα对APL诊断、疗效判定及微小残留病变监测是一种有力手段.
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急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因检测的临床意义探讨
目的 探讨PML-RARα融合基因检测在临床检查急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗前后的意义.研究PML-RARα融合基因含量与急性早幼粒细胞白血病(APL)病变进程的关系.方法 运用RT-PCR技术检测急性早幼粒细胞白血病患者治疗前后骨髓内PML-RARα融合基因含量.结果 所有51例初诊为APL的患者均做PML-RAR α融合基因检测,其中阳性41例,阳性率为80.4％.初诊为APL的51例患者治疗18个月后(进行随访),其中死亡3例,阳性3例,阳性率为5.9％.结论 PML-RARα融合基因的检测对APL诊断具有重要价值.定期检测PML-RAR α基因可尽早发现分子学复发以及时治疗,并避免血液学复发.
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鲍氏威酸诱导急性早幼粒白血病细胞分化与PML/RARα关系的研究
目的:研究鲍氏威酸(BC4)诱导不同融合基因PML/RARα基因型的急性早幼粒白血病(APL)细胞分化的能力及对APL细胞分化相关基因c-myc的表达影响,探讨鲍氏威酸诱导分化作用的机制.方法:采用RT-PCR检测APL细胞PML/RARα的基因型;运用骨髓干、祖细胞集落培养技术分析各基因型APL细胞分别在生理盐水(NS)对照组,鲍氏威酸(BC4)组,全反式维甲酸(ATRA)组培养体系中增殖与分化能力,测定各组集落与丛的形成率,形态分化率,NBT还原率以及粒细胞吞噬率,培养前后各组APL细胞c-myc表达阳性率.结果:与NS对照比较,BC4和ATRA均使PML-RARα+组APL细胞丛形成率明显增高(P＜0.01),而集落形成率无明显变化(P＞0.05),3项细胞分化指标增高(0.01＜P＜0.05),c-myc表达阳性率降低(P＜0.05);BC4对PML/RARα+(L型)诱导分化作用强于PML-RARα+(S型)APL,BC4对部分ATRA治疗后复发耐药病例有诱导分化能力.BC4及ATRA对PML/RARαAPL细胞的各项诱导分化指标无明显改变.结论:BC4对APL具有诱导分化作用,下调c-myc基因表达,其诱导分化能力与PML/RARα-基因型有关,并能诱导部分ATRA耐药细胞分化.
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PML-RARα反义核酸增强NB4细胞对硒化壳聚糖诱导分化作用敏感性的探讨
[目的]研究PML-RARα反义核酸(antisense oligodexynucleotide,ASODN)对硒化壳聚糖诱导的NB4细胞分化敏感性的影响. [方法]人工合成PML-RARαASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染NB4细胞,采用RT-PCR检测转染后PML-RARα基因表达情况,通过镜下观察细胞形态改变,NBT法观察细胞功能变化及流式法检测细胞膜CD11抗原表达来观测细胞分化. [结果]经PML-RARαASODN处理的NB4细胞PML-RARα基因表达明显下调,PML-RARα基因的反义核酸和硒化壳聚槠均能提高细胞NBT还原率,升高CD11b抗原,二者合用,则NBT还原率和CD11b抗原表达进一步增强.[结论]阳离子脂质体转染PML-RARαASODN具有促进硒化壳聚糖诱导NB4细胞分化作用的敏感性.
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急性早幼粒细胞白血病的发病机制及治疗进展
急性早幼粒细胞白血病(APL)是目前发病机制了解清楚的血液系统恶性肿瘤.维甲酸和三氧化二砷直接针对PML-RARα融合蛋白的治疗使得该疾病成为肿瘤靶向治疗的第一个模型,各种新型治疗方案也得到了广泛的关注.现对APL的发病机制及新的临床治疗进展进行总结和讨论.
