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乳酸菌检测方法(综述)
乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌总称,这个名称就细菌分类学而言是一非正式、非规范的名称.目前在自然界已发现的这类菌在细菌分类学上划分出至少23个属 ,涉及到的有关属则更多,包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属等.而相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用.近年来,随着微生态学研究的不断发展,越来越多的实验证明有益细菌对人体健康的重要作用,微生态制剂也因此应运而生.目前我国微生态制剂利用的益生菌近10种,其中除了乳杆菌和乳酸链球菌有国家的标准检验方法外,大部分菌种均无统一的标准方法,难于对该类产品进行质量控制,保证其安全性.故急需建立规范的标准检验方法,以便对微生态制剂进行监督管理,保障其功能、安全性及质量,以保护消费者的健康和利益.本文即对目前国内外用于乳酸菌检测的方法做一综述.
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肠球菌属感染临床特点及耐药性研究
目的 研究肠球菌属感染的临床特点及其耐药性,指导临床合理使用抗菌药物.方法 采用回顾性调查方法对临床分离的924例肠球菌属相关资料进行统计分析.结果 临床标本中肠球菌属在尿液中的分布高,占71.32％;屎肠球菌与粪肠球菌对抗菌药物的耐药率不尽相同,万古霉素耐药菌株逐年增多.肠球菌属引起的院内感染病例占63.42％;60岁以上老年人占64.41％,所有患者均有较严重的基础病.结论 肠球菌已是医院感染的重要致病菌,老年及免疫功能低下患者易感,以尿路感染常见;肠球菌属对多种抗生素耐药,耐万古霉素肠球菌株明显增加.
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肠球菌耐药机制与食源性传播研究进展
肠球菌是社区和医院获得性感染的重要病原菌.目前,肠球菌耐药性日益加重,造成临床治疗肠球菌感染的用药选项在不断减少,给人群健康带来了严重危害.更值得注意的是,肠球菌是食物链中耐药基因的"存储池",可以将耐药基因传递给其他细菌,给食品安全和人群健康带来严重风险.本文综述了肠球菌的致病性、耐药性、耐药机制、食源性肠球菌耐药性在人畜间传播的新研究进展,展望了控制和降低食源性肠球菌耐药性的措施.
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万古霉素耐药基因研究进展及纳米技术在提高万古霉素抗菌活性中的应用
万古霉素（vancomycin）是用于治疗由革兰阳性菌引起的严重感染疾病的抗生素。万古霉素能够与肽聚糖合成前体 lipoII中的 D-Ala-D-Ala末端结合，从而抑制转肽反应来阻断高分子肽聚糖的合成，造成细菌因细胞壁缺陷破裂而死亡[1]。自1986年首次分离得到具有万古霉素抗性的肠球菌菌株后，万古霉素抗性在肠球菌属中广泛传播。目前关于万古霉素耐药基因的研究已经取得了一定的成果。1990年，发现 vanA 基因能诱导生成相应的抗性蛋白 vanA，其具有 D-Ala-D-Lac连接酶活性。而后又陆续发现了vanH和vanX 等基因，且细胞壁合成途径的改变需要有 vanH、vanA、vanX 等基因的参与[2]。截止目前，有多种万古霉素耐药基因已被发现并鉴定了部分耐药基因在基因簇中的位置和编码产物，汇总于表1。针对万古霉素的耐药越来越普遍的现象，如何增强万古霉素的抗菌活性就显得尤为重要。目前以纳米颗粒装载万古霉素的给药方式显示出了巨大的优势[3]。本文将就近几年有关万古霉素耐药基因的研究以及提高其抗菌活性的研究进行综述。
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医院感染肠球菌属的特征及耐药性分析
肠球菌为条件致病菌,是医院感染的重要病原菌之一,可引起不同部位的感染,主要以泌尿系统、呼吸道和伤口感染为主.对我院2006年9月-2008年9月间临床分离的102株肠球菌的菌种分布和耐药性进行了回顾性调查分析,现报道如下.
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健康成人与住院病人肠球菌致病基因及表型和耐药性的比较研究
目的调查健康成人与住院病人分离肠球菌致病基因、致病表型和耐药性的携带情况,以了解肠球菌在医院感染中的意义.方法应用PCR检测肠球菌cylA、gelE、esp、ace、agg和efaA等6种致病基因,并用斑点杂交和基因测序确证.应用β溶血试验、明胶溶解和生物膜形成检测3种致病表型.应用琼脂稀释法检测肠球菌对高浓度庆大霉素、高浓度链霉素、万古霉素和氨苄西林的耐药性.结果健康成人和住院病人粪肠球菌中均检测到6种致病基因,前者检出率7.4～40.7%,后者检出率29.0～80.6%;屎肠球菌健康成人分离菌株检测出3种致病基因,检出率5.6～16.7%;住院病人分离菌株检测出4种致病基因,检出率21.1～57.9%.健康成人和住院病人肠球菌β溶血、明胶溶解和生物膜形成的检出率分别为26.7%,54.0%;13.3%,40.0%;97.8%,90.0%.健康成人和住院病人屎肠球菌耐药率分别为22.2～94.4%,68.4～100.0%;粪肠球菌分别为3.7～33.3%,29.0～64.5%.结论健康成人分离株较住院病人分离株的致病性弱,屎肠球菌比粪肠球菌的耐药性高.
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肠球菌鉴定和药敏试验室间质控结果分析
肠球菌属是目前院内感染的重要病原菌之一,具有耐药性强和多重耐药的特点,可引起人体多种组织脏器的感染,特别是免疫功能低下患者的严重感染[1].近年来肠球菌属细菌所致感染有不断增加的趋势,因此做好肠球菌的鉴定和药敏试验具有十分重要的意义,而做好肠球菌鉴定和药敏试验的室间质量控制是提高肠球菌检验水平的有效方法之一.
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肠球菌医院感染现状及耐药性分析
目的 了解肠球菌属的临床分布和耐药性变化,为临床合理用药提供依据.方法 采用VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统对2007年3月至2010年2月间临床送检标本中分离的180株肠球菌进行鉴定和药敏试验,并对数据进行统计分析.结果 三年内肠球菌检出率逐年增加分别为3.05%、3.14%、4.34%.180株肠球菌中以屎肠球菌多为116株(64.44%),粪肠球菌50株(27.78%),其他种类肠球菌14株(7.80%).菌株来源以尿液多(43.33%),其次是痰液、分泌物,比例均大于10%.临床分布以肾病内科多为32株(17.78%),其次为普外科26株(14.44%)、泌尿外科24株(13.33%)均占较大比例.药敏结果显示耐药率低的是万古霉素(0.00%),其次是替考拉宁(0.92%)、利奈唑胺(2-49%)等,耐药率高的是红霉素(94.81%).屎肠球菌对多种抗生素的耐药率均高于粪肠球菌,仅对四环素、喹努普汀/达福普汀等的耐药率低于粪肠球菌.三年间粪肠球菌和屎肠球菌对四环素耐药率均逐年升高.结论 作为医院感染重要致病菌,肠球菌分离率逐渐增加,多重耐药日趋严重且不同菌种的耐药率差别很大,临床上在用药时应结合药敏结果合理选择抗生素.
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肠球菌对氟喹诺酮类药物的敏感性及其主动外排机制的研究
目的 研究主动外排泵抑制剂利血平对氟喹诺酮类药物抗肠球菌活性的影响,以及外排泵基因emeA的存在与耐药的相关性,以探讨主动外排作用在肠球菌耐药中所起的作用.方法 采用全自动微生物分析仪(Vitek-2 Compact)将临床分离的100株肠球菌鉴定到种,采用K-B琼脂纸片扩散法进行药物敏感试验,应用琼脂稀释法检测3种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星)对肠球菌的MIC,同时检测在加入利血平后3种药物MIC的变化情况,用PCR检测编码外排泵的基因emeA在100株肠球菌属细菌中的分布,采用X2检验进行统计学分析.结果 应用利血平后,肠球菌对3种氟喹诺酮类药物的耐药率都减低:环丙沙星耐药率从42％ (42/100)降至28％(28/100),加替沙星耐药率从30％(30/100)降至17％(17/100),左氧氟沙星耐药率从33％(33/100)降至23％(23/100);100株肠球菌属细菌中emeA基因的阳性率为55％,其中62株粪肠球菌中阳性者45株(72.6％),38株屎肠球菌中阳性者10株(26.3％);环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星耐药株中emeA基因的阳性率依次为73.8％ (31/42)、76.7％(23/30)、75.8％(25/33),敏感株中emeA基因的阳性率依次为41.4％(24/58)、45.7％(32/70)、44.8％(30/67);外排泵基因emeA在耐药株中的阳性率高于敏感株,差异有统计学意义(x2=13.02,8.13,8.57,P均＜0.005).结论 利血平在体外可以抑制肠球菌对3种氟喹诺酮类药物的主动外排作用,降低肠球菌的MIC值.肠球菌多重耐药外排基因emeA的存在与肠球菌属对抗菌药物的耐药具有相关性.
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利奈唑胺耐药肠球菌的分子流行病学和感染危险因素分析
目的 探究利奈唑胺耐药肠球菌(LRE)的分子流行病学特点和感染危险因素.方法 2011至2013年共收集重庆医科大学附属第一医院13株利奈唑胺耐药肠球菌,采用微量肉汤稀释法对菌株进行验证,并通过法国生物梅里埃Vitek 2对12种抗生素进行MIC检测;多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、Diversilab进行分子流行病学调查;对患者病例资料进行回顾性分析,采用Logistic回归模型来明确利奈唑胺耐药肠球菌的独立危险因素.结果 13株利奈唑胺耐药肠球菌均对利奈唑胺呈现低水平耐药,对四环素、红霉素、环丙沙星多表现耐药,对青霉素、氨苄西林、替加环素等多表现敏感;我院以ST480型别为主,其中2013年7至9月有3株菌(菌株3～5)具有相同的序列分型(ST)型别、PFGE条带和rep-PCR分型结果,属于同一耐药克隆群;入住ICU、周围血管疾病、男性、低蛋白血症、肠道灌洗和利奈唑胺使用等是利奈唑胺耐药肠球菌的主要危险因素,其中,入住ICU(OR=8.74;P =0.008)、肠道灌洗(OR=8.39;P=0.015)、利奈唑胺使用(OR=10.19;P =0.039)是其独立危险因素.结论 13株LRE均为多重耐药菌株,2013年下半年存在小规模的LRE流行,应重视LRE的监管工作,从而减少利奈唑胺耐药菌株的出现.
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肠球菌表面蛋白基因在粪肠球菌生物被膜形成中的作用
肠球菌属是寄居于人体口腔和肠道的正常菌群,但过去20年来逐渐成为重要的机会致病菌,并成为导致院内感染,诸如血流感染、尿路和外科术后感染的重要病原体之一[1].肠球菌还与多种置入医疗器械[2],如导尿管,静脉插管和人工心瓣膜[3]所引起的生物膜相关感染有关.肠球菌表面蛋白(esp)是一种大分子量的表面蛋白,esp基因在感染源性的粪肠球菌中分离率很高[4],并且由于它具有介导细菌黏附的功能而在粪肠球菌生物膜的研究中逐渐引起重视.
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耐万古霉素肠球菌的基因检测
目的 调查上海华山医院2007-2009年间VRE的分离率,并对耐药菌株的分子特性进行研究,为本地区VRE的预防和控制提供有价值的信息.方法 通过琼脂平板稀释法(ADSP)从临床鉴定的890株肠球菌中筛选VRE菌株,并通过微量肉汤稀释实验测其对万古霉素及替考拉宁的MIC;采用PCR及测序方法检测万古霉素耐药基因以及可能毒力基因esp,hyl;运用MLST对VRE进行克隆分型并通过PFGE分型技术进行验证.结果 ADSP法及微量肉汤稀释实验共筛选出13株VRE菌株.其中6株VRE(2007-2008年)只对万古霉素耐药,但对于替考拉宁敏感(万古霉素MIC64～256μg/ml);耐药基因PCR产物测序结果提示这6株VRE均携带同一种可能导致万古霉素耐药的新型基因,该基因序列与已报道的耐药基因均不同;MLST及PFGE分型提示其属于不同型别.另外7株VRE(2009年1-7月)对万古霉素和替考拉宁的MIC结果分别为32～64μg/ml和16～32 μg/ml,耐药基因检测均为vanA.MLST分型结果提示13株VRE共分为4个不同的ST型,其中11株均属克隆复合型CC-17.13株VRE毒力基因esp和hyl的阳性率分别为69.2%和30.8%.结论 上海华山医院VRE克隆分型以CC17为主,同时发现上海华山医院存在一种可能导致万古霉素耐药的新型基因介导的VRE,该新基因的功能和定位尚待进一步研究.
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儿科临床分离肠球菌的耐药性监测及大环内酯类耐药机制研究
目的 研究儿科临床分离肠球菌的流行情况及红霉素耐药株基因ermB、mefA、tetM与转座子整合酶基因int-Tn分布特点.方法 采用KB纸片法对北京、上海、广州和重庆5家儿科专科医院2000-2006年临床分离粪、屎肠球菌进行8种抗菌药敏感性试验,并用琼脂稀释法测定225株红霉素耐药粪、屎肠球菌对大环内酯类及四环素小抑菌浓度.PCR检测红霉素耐药基因ermB和mefA,四环素耐药基因tetM,以及转座子Tn1545的整合酶基因int-Tn.结果 4地5家儿童医院分离所得肠球菌对红霉素耐药率高,平均耐药率86.5%;对氨苄西林、高浓度链霉素、高浓度庆大霉素、环丙沙星及利福平的耐药率分别为48.0%、47.6%、60.5%、45.4%、63.6%;未发现对万古霉素耐药的肠球菌.225株红霉素耐药粪、屎肠球菌ermB基因阳性率为70.7%,仅发现1株对mefA阳性的菌株.tetM基因阳性率为75.1%.Tn1545基因阳性株组ermB和tetM的携带率分别为84.8%和83.7%,高于阴性组60.9%和70.0%,且差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 我国儿科临床分离粪、屎肠球菌对多种抗菌药均有较高耐药率,对糖肽类抗菌药均保持较好敏感性,分离株对红霉素和四环素耐药主要机制分别是ermB编码的靶位改变和tetM编码的核糖体保护作用;接合性转座子Tn1545与tetM和ermB存在关系密切,可能是肠球菌多重耐药的重要机制之一.
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VanB表型-vanA基因型VRE分子特征及遗传背景研究
目的 探讨VanB表型-vanA基因型VRE耐药转座子结构、分子特征及遗传背景,并与VanA表型-vanA基因型VRE进行比较分析,以确定基因型与表型不一致的形成机制.方法 收集2008年3月至2009年1月卫生部北京医院临床标本中21株VRE菌株,用Etest法对10种抗生紊进行MIC测定,并通过PCR、序列测定、接合试验、耐药转座子结构、PFGE及MLST进行分子特征和遗传背景研究.结果 21株VRE均为vanA基因型,其中3株菌呈现VanB表型(万古霉素耐药,替考拉宁敏感);21株菌属于9个不同PFGE型,6个不同MIST型;多对引物对转座子的不同区域PCR扩增并进行序列拼接、比对,发现Tn1546结构中vanX、vanY的缺失及ISEfa4的插入与VanB表型-vanA基因型VRE菌株形成相关.结论 VanB表型-vanA基因型VRE菌株在国内较为罕见,Tn1546结构的改变与菌株的基因型与表型不一致相关.
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利奈唑胺对肠球菌属和葡萄球菌属的体外抗菌活性研究
利奈唑胺为一种合成的(口恶)唑烷酮类抗菌药物,通过阻碍核糖体形成起始复合物从而抑制细菌蛋白质合成起始阶段,发挥抗菌作用,对革兰阳性球菌包括多重耐药的葡萄球菌有较好的抗菌活性,具有口服生物利用度高的特点.利奈唑胺自2000年临床使用以来,在治疗多重耐药的阳性球菌引起的感染方面起到了非常重要的作用[1].
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对万古霉素耐药的11株肠球菌的药敏表型及基因检测
目的检测11株耐万古霉素肠球菌(VRE)的耐药表型、基因型以及多耐基因.方法采用纸片扩散法、微量稀释法、自动化仪器、浓度梯度法测定11株VRE对万古霉素(Van)、替考拉宁(Tec)的耐药表型,微量稀释法测定11株VRE对10种抗菌药物的低抑菌浓度;多重聚合酶链反应检测vanA、vanB、vanC1、vanC2并对van基因产物进行测序,聚合酶链反应检测TEM、tetM、ermB、aac(6′)/aph(2′′)、ant(6)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅲ基因.结果不同药敏方法测得11 株VRE对Van、Tec的药敏结果有差异;11 株VRE对红霉素(9/11)、环丙沙星(7/11)、左氧氟沙星(7/11)、利福平(8/11)、氯霉素(7/11)耐药程度较高,高水平庆大霉素耐药株(HLGR)、高水平链霉素耐药株(HLSR)分别占10/11和9/11.11株VRE检出1株VanA、4株VanB、5株VanC1,1株VanC2,基因型和表型一致;耐药基因TEM(8/11)、tetM(6/11)、ermB(7/11)、aac(6′)/aph(2′′)(7/11)、ant(6)- I(5/11)、aph(3′)-Ⅲ(9/11)检出率高.结论 VRE确证试验以及准确检测其 MIC值是筛查VRE不漏诊的可靠方法;van基因的检测是从分子水平确定VRE准确特异的方法;耐药基因的高检出率体现了VRE复杂的耐药机制.
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肠球菌部分致病基因和表型的检测
目的调查临床分离的肠球菌6种致病基因和2种表型的分布. 方法应用聚合酶链反应和斑点杂交技术检测临床分离的145株肠球菌的6种致病基因,用7%兔血平板和3%明胶平板检测β溶血和明胶溶解表型.结果粪肠球菌和屎肠球菌6种致病基因的检出率分别为gelE 72.9%、30.6%;efaA 79.2%、36.7%;cylA 54.2%、34.7%;esp 34.4%、36.7%;agg 18.8%、0;ace28.1%、0.粪肠球菌和屎肠球菌β溶血分别为45.8%、20.4%;明胶溶解分别为35.4%、16.3%.结论粪肠球菌6种致病基因和2种表型的检出率高于屎肠球菌;尿标本比痰标本肠球菌致病基因的检出率高;gelE、efaA和cylA在粪肠球菌中的检出率高于其他致病基因.
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肠球菌氨基糖苷类高水平耐药基因的检测
目的调查肠球菌对高水平氨基糖苷类的耐药情况,并检测其耐药基因.方法琼脂稀释法筛选对氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌,PCR扩增5种高耐药基因:双功能酶AAC(6′)-APH(2″)的编码基因aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia,磷酸转移酶APH(2″)-Id、APH(2″)-Ib的编码基因aph(2″)-Id、aph(2″)-Ib,核苷酸转移酶ANT(6′)、ANT(3″)(9)的编码基因ant(6′)-Ia 和ant(3″)(9),并通过PCR产物的基因测序及寡核苷酸探针斑点杂交试验验证结果的可靠性.结果粪肠球菌对氨基糖苷类高水平耐药率达63%,屎肠球菌达84%.95%以上庆大霉素高耐肠球菌(HLGR)检测到aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia、3株HLGR肠球菌检测到aph(2″)-Id, 99%以上HLSR肠球菌检测到ant(6′)-Ia. 结论肠球菌对氨基糖苷类高水平耐药十分普遍,双功能酶AAC(6′) -APH(2″)、核苷转移酶ANT(6′) 分别介导了大多数肠球菌对庆大霉素、链霉素的耐药.
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临床分离肠球菌属耐药性及耐药基因的研究
肠球菌属是医院感染的重要病原菌,可造成泌尿系统感染、伤口感染、腹膜炎、心内膜炎和败血症等.据中国全国医院感染监控网及美国医院感染监测系统(No socomial Infections Surveillauce System,NISS)监测显示,肠球菌属已成为医院感染的重要病原菌,在中国是革兰阳性菌感染中除葡萄球菌属外的第二大菌属.
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杭州市五家医院万古霉素耐药肠球菌耐药转座子结构及分子分型
目的 明确万古霉素耐药肠球菌(VRE)耐药转座子结构及分子分型.方法 收集2006年4月至2007年4月杭州市5家医院21株VRE菌株,用Etest法进行抗菌药物的药敏试验,并通过PCR、接合试验、质粒提取、耐药转座子结构、脉冲凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MIST)及多位点串联重复序列分型(MLVA)进行研究.结果 21株VRE基因型及表型均符合vanA.属于10个不同的PFGE型,7个不同的MLST分型,4个不同的MLVA分型,其中18株属于克隆复合体CC17,另外3株为ST343与CC17接近.所有VRE菌株均对利奈唑胺及替加环素敏感.多对引物对转座子的不同区域的PCR扩增并进行序列拼接、比对,发现其中2株VRE菌株携带典型的耐药转座子Tn1546,其余19株VRE菌株均携带一种新的与Tn1546相似耐药转座子,均在vanXY之间反向插入IS1485.18株VRE菌株均可通过滤膜接合试验进行万古霉素耐药转移,接合菌均含有约54 000 bp大小的质粒.结论 杭州市5家医院21株VRE菌株均为vanA表型及基因型,发现了一种新的万古霉素耐药转座子结构.21株VRE菌株经MLST分型属于7个不同的序列分型,属于或接近易在医院环境里生存并在近年来迅速造成了全球播散的克隆复合体CC17.
