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万古霉素非敏感肠球菌的筛选和基因型分析
目的：对实验室保存的325株肠球菌进行万古霉素非敏感肠球菌筛选，并对筛选出的菌株进行耐药表型、耐药基因型、菌株同源性分析。方法采用琼脂平皿二倍稀释法筛选万古霉素非敏感肠球菌，并检测菌株对替考拉宁的敏感性；采用 PCR方法检测万古霉素非敏感肠球菌的耐药基因型；通过肠道细菌基因间重复一致序列（ERIC）PCR 技术、脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术、多位点序列分型（MLST）技术进行菌株的同源性分析。结果从325株临床分离肠球菌中共筛选出17株万古霉素非敏感肠球菌，包括1株粪肠球菌、11株屎肠球菌和5株鹑鸡肠球菌。其中1株粪肠球菌和11株屎肠球菌对万古霉素显示高水平耐药，对替考拉宁耐药或中介耐药， PCR检测结果显示 vanA型；5株鹑鸡肠球菌对万古霉素中介耐药，对替考拉宁敏感，PCR检测结果显示 vanC1型。ERIC 同源性分析显示同基因型的大多数菌株显示相似的分型；PFGE 同源性分析显示，17株临床万古霉素非敏感肠球菌分型不同，不属于单克隆流行播散；MLST 同源性分析显示，1株临床万古霉素非敏感粪肠球菌属于 ST4，11株临床万古霉素非敏感屎肠球菌共分为6个 ST型，其中4株属于 ST78，是屎肠球菌出现频率高的 ST型。结论我国万古霉素耐药菌在粪肠球菌中分离率较低，但屎肠球菌中万古霉素耐药情况较严重，并且耐药菌株携带易于传播和转移的 vanA基因。同源性分析结果显示万古霉素耐药存在同源性传播的可能性。
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耐万古霉素肠球菌的基因检测
目的 调查上海华山医院2007-2009年间VRE的分离率,并对耐药菌株的分子特性进行研究,为本地区VRE的预防和控制提供有价值的信息.方法 通过琼脂平板稀释法(ADSP)从临床鉴定的890株肠球菌中筛选VRE菌株,并通过微量肉汤稀释实验测其对万古霉素及替考拉宁的MIC;采用PCR及测序方法检测万古霉素耐药基因以及可能毒力基因esp,hyl;运用MLST对VRE进行克隆分型并通过PFGE分型技术进行验证.结果 ADSP法及微量肉汤稀释实验共筛选出13株VRE菌株.其中6株VRE(2007-2008年)只对万古霉素耐药,但对于替考拉宁敏感(万古霉素MIC64～256μg/ml);耐药基因PCR产物测序结果提示这6株VRE均携带同一种可能导致万古霉素耐药的新型基因,该基因序列与已报道的耐药基因均不同;MLST及PFGE分型提示其属于不同型别.另外7株VRE(2009年1-7月)对万古霉素和替考拉宁的MIC结果分别为32～64μg/ml和16～32 μg/ml,耐药基因检测均为vanA.MLST分型结果提示13株VRE共分为4个不同的ST型,其中11株均属克隆复合型CC-17.13株VRE毒力基因esp和hyl的阳性率分别为69.2%和30.8%.结论 上海华山医院VRE克隆分型以CC17为主,同时发现上海华山医院存在一种可能导致万古霉素耐药的新型基因介导的VRE,该新基因的功能和定位尚待进一步研究.
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VanB表型-vanA基因型VRE分子特征及遗传背景研究
目的 探讨VanB表型-vanA基因型VRE耐药转座子结构、分子特征及遗传背景,并与VanA表型-vanA基因型VRE进行比较分析,以确定基因型与表型不一致的形成机制.方法 收集2008年3月至2009年1月卫生部北京医院临床标本中21株VRE菌株,用Etest法对10种抗生紊进行MIC测定,并通过PCR、序列测定、接合试验、耐药转座子结构、PFGE及MLST进行分子特征和遗传背景研究.结果 21株VRE均为vanA基因型,其中3株菌呈现VanB表型(万古霉素耐药,替考拉宁敏感);21株菌属于9个不同PFGE型,6个不同MIST型;多对引物对转座子的不同区域PCR扩增并进行序列拼接、比对,发现Tn1546结构中vanX、vanY的缺失及ISEfa4的插入与VanB表型-vanA基因型VRE菌株形成相关.结论 VanB表型-vanA基因型VRE菌株在国内较为罕见,Tn1546结构的改变与菌株的基因型与表型不一致相关.
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异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌对临床细菌感染治疗的影响
以往认为细菌不易对万古霉素产生耐药,但近年来国际上许多国家和地区报道了万古霉索的耐药性现象,其中异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌(hVISA)受到了关注,因其发生率上升而又不易被检测,影响了细菌感染的治疗.本期刊登了王辉教授课题组以可靠的检测方法 时分离自我国14个城市的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌进行了hVISA检测,首次发现hVISA在我国的发生率高,应引起临床医师的重视.
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杭州市五家医院万古霉素耐药肠球菌耐药转座子结构及分子分型
目的 明确万古霉素耐药肠球菌(VRE)耐药转座子结构及分子分型.方法 收集2006年4月至2007年4月杭州市5家医院21株VRE菌株,用Etest法进行抗菌药物的药敏试验,并通过PCR、接合试验、质粒提取、耐药转座子结构、脉冲凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MIST)及多位点串联重复序列分型(MLVA)进行研究.结果 21株VRE基因型及表型均符合vanA.属于10个不同的PFGE型,7个不同的MLST分型,4个不同的MLVA分型,其中18株属于克隆复合体CC17,另外3株为ST343与CC17接近.所有VRE菌株均对利奈唑胺及替加环素敏感.多对引物对转座子的不同区域的PCR扩增并进行序列拼接、比对,发现其中2株VRE菌株携带典型的耐药转座子Tn1546,其余19株VRE菌株均携带一种新的与Tn1546相似耐药转座子,均在vanXY之间反向插入IS1485.18株VRE菌株均可通过滤膜接合试验进行万古霉素耐药转移,接合菌均含有约54 000 bp大小的质粒.结论 杭州市5家医院21株VRE菌株均为vanA表型及基因型,发现了一种新的万古霉素耐药转座子结构.21株VRE菌株经MLST分型属于7个不同的序列分型,属于或接近易在医院环境里生存并在近年来迅速造成了全球播散的克隆复合体CC17.
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2007年中国14个城市异质性万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌分子特征
目的 研究我国异质性万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(hVISA)的分子特征,比较hVISA和万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌(VSSA)在分子特征方面的差别.方法 收集2007年来自全国14个城市分离的非重复甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)315株,采用PAP-AUC(菌群谱型分析-曲线下面积法)确定hVISA.通过多重PCR对315株MRSA进行SCCmec分型及agr (accessory gene regulator)分型,对PCR产物进行测序确定spa分型,同时检测pvl基因.结果 在315株MRSA中共检测出30株hVISA,发生率为9.5%.315株MRSA以SCCmec Ⅲ为主,占74.3%,其次为SCCmec Ⅱ,占17.8%.在hVISA中SCCmec Ⅱ的比例明显高于VSSA组(46.7%比14.7%,X~2=18.93,P＜0.001).所有MRSA的agr分型以agr 1为主,占73.6%,其次为agr 2,占18.7%,agr3和agr 4型MRSA在临床分离株中少见.agr分型在hVISA和VSSA之间有明显的不同,hVISA中agr 2的比例显著高于VSSA(53.4%比15.1%,X~2=26.08,P＜0.001).30株hVISA中有4种spa克隆型,包括t002(13株)、t037(9株)、t030(6株)和1548(2株).315株MRSA中pvl基因的携带率非常低,占1.6%.结论 hVISA的发生率较高.与VSSA相比,hVISA主要以agr 2型为主,与VSSA明显不同.通过spa分型发现hVISA呈多克隆型.
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重症监护病房耐万古霉素肠球菌耐药性与耐万古霉素基因及毒力因子研究
目的 分析重症监护病房(ICU)耐万古霉素肠球菌(VRE)的耐药性及万古霉素耐药基因和毒力因子携带情况.方法 连续收集2012年9月至2013年5月天津医科大学总医院ICU住院患者180份肛周拭子样本,采用ChromID VRE产色培养基筛选出VRE,Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪检测菌株对常用抗菌药物的敏感性,同时采用Kirby-Bauer纸片扩散法对其进行万古霉素及替考拉宁的药敏试验;运用PCR方法检测万古霉素耐药基因vanA、vanB、vanC1和其携带的毒力基因esp和hyl.结果 180份肛周拭子样本中共筛选出VRE 19株,均为耐万古霉素屎肠球菌.19株耐万古霉素屎肠球菌对万古霉素和替考拉宁均为耐药,但对利奈唑烷和替加环素均为敏感.所有VRE菌株均携带vanA基因和毒力因子esp基因,其中10株同时携带hyl毒力因子基因.结论 ICU中VRE耐药现状较严重,耐药基因和毒力因子基因携带率高,利奈唑烷和替加环素可作为治疗VRE感染的推荐药物.
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肠球菌对利奈唑胺耐药机制的研究进展
肠球菌属是医院感染的条件致病菌.近年来,随着抗菌药物的广泛使用,肠球菌对抗菌药物的耐药率呈逐年上升趋势,甚至出现了耐万古霉素肠球菌(VRE).利奈唑胺是人工合成的恶唑烷酮类抗菌药物,由于不易与其他抑制细菌蛋白合成的抗菌药物发生交叉耐药,曾被认为是治疗VRE的后一道防线.但自利奈唑胺上市以来,有关耐利奈唑胺肠球菌的报道相继出现.本文就近年来有关肠球菌对利奈唑胺的耐药机制作一综述,以期为耐药监测和新型抗菌药物的研发提供依据.
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利奈唑胺替代万古霉素治疗颅内细菌性感染的初步探讨
目的 初步探讨利奈唑胺(LZD)对怀疑万古霉素耐药的细菌性颅内感染患者的疗效及安全性.方法 前瞻性纳入2015年8月至2016年9月天津医科大学总医院神经外科重症监护病房因怀疑为革兰阳性球菌致颅内感染、且连续应用万古霉素≥7d疗效不佳而改用IZD治疗(600 mg,静脉滴注,1次/12 h)的患者11例.评价LZD治疗颅内细菌感染的疗效及安全性.结果 11例患者中,10例治愈,1例死亡.LZD平均治疗时间为(22.3±5.3)d.LZD治疗后,5例出现血常规的多项指标下降,其中1例死亡,4例停药后恢复正常;血常规指标下降患者的中位年龄为60(QR:21.5)岁,高于未下降者的33(QR:20)岁,差异有统计学意义(P=0.017).随访中未发现LZD诱导血常规持续异常及其他相关不良反应.结论 在严密监测血常规的前提下,LZD可以作为万古霉素治疗无效的颅内革兰阳性球菌感染患者的替代选择药物.
关键词： 中枢神经系统细菌感染 革兰阳性球菌 万古霉素抗药性 利奈唑胺 -
耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证
目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA，vanB）序列，设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针，制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段，标记产物与基因芯片上的探针杂交，经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下，评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性，灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法，利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。
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胆管癌术后并发耐万古霉素屎肠球菌血流感染1例
患者，男性，60岁。主因发现皮肤、巩膜黄染10 d，于2013年8月26日入院。缘于10 d前无诱因发现皮肤、巩膜黄染，伴尿黄，呈浓茶色，无明显皮肤瘙痒，无明显腹痛腹胀，无恶心呕吐，无寒战发热。高血压2年，高190／100 mmHg。目前口服非洛地平5 mg，2次／d，监测血压130／80 mmHg。否认其他疾病及外伤史，无食物、药物过敏史。入院查体：体温36．8℃，脉搏76次／min，呼吸18次／min，血压130／80 mmHg。实验室检查：丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）511 U／L，天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）267 U／L，碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）262 U／L，谷氨酰转移酶（glutamyl transpeptidase，GGT）718 U／L，总胆红素（total bilirubin ，TBIL ）198．6μmol／L ， ；直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）122．1μmol／L，血钾320 mmol／L。B超示胆总管下段等回声（不除外实性占位），胆囊体积增大，胆总管增宽。胸片示两肺纹理增多。心电图示窦性心律，正常心电图。CT示胰头体积增大，胆总管下段显示欠清，肝内胆管、胆总管中上段、胰管扩张；左肺下叶条索影。磁共振胰胆管造影示胆总管中段截断，伴高位胆系梗阻，胰管扩张。胃镜示胃角见一凹陷性糜烂，病理示中度慢性炎性伴中度肠化。便常规示灰白色软便。入院诊断：①壶腹周围占位性病变，梗阻性黄疸；②高血压3级极高危组；③电解质紊乱，低钾血症。入院后行全麻下剖腹探查、胰十二指肠切除术。术后诊断：胆总管下段癌，胰头钩突、十二指肠系膜、腹主动脉受侵；梗阻性黄疸；高血压3级极高危组；电解质紊乱，低钾血症。术前30 min及术后头孢西丁2 g，3次／d 静脉滴注2 d。其他支持及对症处理。术后2 d间断发热37．8～38．5℃，医师更换抗菌药物为头孢哌酮舒巴坦2 g，每8 h静脉滴注1次，联合甲硝唑05 g，2次／d静脉滴注。随后几天，患者体温下降，无发热。有痰，量不多，可自行咳出，未诉明显腹痛、腹胀，有自主排气，可排便，为黄绿色软便，无胸闷、喘憋及呼吸困难症状。术后第8天晨患者发热387℃，无寒战，仍有痰，可自行咳出。未诉明显腹痛、腹胀，有自主排气，可排便，为黄绿色软便，无胸闷、喘憋及呼吸困难。腹部引流管固定良好、通畅，引流液淡黄色，胰肠吻合口旁引流0．5 mL，胆肠吻合口旁引流6 mL，盆腔引流4 mL。肠鸣音正常。胃管固定良好，胃液深绿色，量约100 mL。实验室检查：白细胞19．4×109／L，中性粒细胞0．774，血红蛋白115g／L，血小板375×109／L，ALT 46 U／L， AST 29 U／L，TBIL 59．8μmol／L，DBIL 385μmol／L，血钾3．20 mmol／L。曾经验用美罗培南1g每8h静脉滴注1次。但术后15d患者再次出现发热，高40℃，无寒战，无咳嗽、咳痰，无胸闷、喘憋及呼吸困难，无尿频、尿急、尿痛，无腹痛、腹胀。引流管已拔出，肠鸣音正常。白细胞8．2×109／L，中性粒细胞0．768，血培养回报革兰阳性球菌生长，以葡萄球菌属或肠球菌为主。医师立即再次抽血培养，抗菌药针对阳性菌调整为去甲万古霉素0．8 g，每12 h静脉滴注1次。应用去甲万古霉素未控制住感染，患者第2天再次出现寒战、发热，体温高39℃，仍无其他症状。血培养回报示屎肠球菌。药敏对利奈唑胺敏感，替考拉宁中介，万古霉素耐药。因利奈唑胺药库采购不到药，药师指导医师抗菌药调整为替考拉宁400 mg，每12 h 静脉滴注1次，3次后改400 mg，1次／d；美罗培南1 g，每8 h静脉滴注1次；磷霉素4 g，每8 h静脉滴注1次。第 2次血培养回报还是屎肠球菌，药敏对利奈唑胺敏感，替考拉宁中介，万古霉素耐药。后患者体温波动在36．9～38．8℃之间。术后第23天再次抽血，血培养回报示白色假丝酵母菌，药敏对氟康唑敏感。医师加用氟康唑0．4g 1次／d静脉滴注；并再次抽血培养回报：热带假丝酵母菌，氟康唑、伊曲康唑等敏感。继续上述治疗，未控制住感染，患者持续发热。因采购不到利奈唑胺，医师建议患者转上一级医院治疗，患者转院。
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肠球菌万古霉素高水平耐药基因vanA、vanB、vanD和vanM快速分型检测
目的 建立基于多重PCR技术的肠球菌万古霉素高水平耐药基因vanA、vanB、vanD和vanM的快速分型检测方法.方法 通过分析可介导肠球菌万古霉素高度耐药的D-丙氨酸:D-乳酸(D-Ala:D-Lac)连接酶基因序列差异,设计可同时检测肠球菌万古霉素高水平耐药基因vanA、vanB、vanD和vanM的多重PCR分型检测方法,以含vanA、vanB、vanD和vanM基因的重组质粒为阳性对照,以临床常见病原菌DNA为阴性对照,评价其敏感度及特异度.采用新建方法检测50株万古霉素耐药临床分离株,50株万古霉素耐药肠球菌(VRE)临床株于2006年1月至2014年12月分离自上海地区9家医院,并与常规PCR及测序方法比较.结果 vanA、vanB、vanD和vanM基因核苷酸序列一致率为60.8%~71.3%,根据序列差异建立的分型方法可对不同基因型阳性对照样品进行准确分型.所有阴性对照样品均未出现假阳性.检测50株临床分离VRE,18株为vanA型,32株为vanM型,与常规PCR及测序方法比较,敏感度及特异性度均为100.0%.检测下限2×10拷贝/PCR反应,检测可在3.5h内完成.结论 建立了一种基于多重PCR技术的VRE万古霉素高水平耐药基因快速分型方法,可用于VRE菌株的分子流行病学研究及检测.
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下呼吸道分离葡萄球菌对万古霉素异质性耐药
[目的]探讨万古霉素体外敏感,体内治疗失败的原因.[方法]选择本实验室1997年至1999年下呼吸道分离的115株耐甲氧西林葡萄球菌,用美国临床实验室标准委员会推荐的M-H琼脂板稀释法测定对万古霉素的敏感性;脑心浸液琼脂诱导对万古霉素异质性耐药株,用生物梅里埃公司APIStaph系统鉴定菌型;进一步用E-Test试条检测万古霉素敏感性.[结果]115株耐甲氧西林葡萄球菌对万古霉素敏感性下降34株(MIC＞4 mg/L):金黄色葡萄球菌13株,溶血葡萄球菌7株,松鼠葡萄球菌7株,表皮葡萄球菌3株,人葡萄球菌3株,产色葡萄球菌1株.万古霉素高度异质性耐药9株:金黄色葡萄球菌3株,溶血葡萄球菌6株;E-Test拭条在脑心浸液琼脂板中万古霉素异质性耐药葡萄球菌显示双重抑菌环.[结论]对万古霉素异质性耐药可能是万古霉素治疗医院内耐甲氧西林葡萄球菌感染失败的重要原因之一.
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青霉素结合蛋白与金黄色葡萄球菌耐药性关系研究
金黄色葡萄球菌(SA)是造成医院内感染和社区感染的常见病原菌之一.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)等多重耐药菌出现,在医学界引起了广泛关注.青霉素结合蛋白(PBPs)的改变与MRSA和VRSA的耐药机制有密切关系.研究青霉素结合蛋白与MRSA和VRSA耐药性之间关系有重要意义.
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金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药机制的研究进展
万古霉素是治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的首选药物,随着临床万古霉素用量增加而产生的万古霉素敏感性降低的金黄色葡萄球菌感染使治疗变得十分困难,引起医学界的广泛关注.现就金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药机制作一综述.
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异源性耐万古霉素金黄色葡萄球菌的研究进展
MRSA是医院内感染的重要致病菌之一,万古霉素是唯一有效的药物,但万古霉素的应用未能明显降低极高的病死率,异源性耐万古霉素金葡菌的存在可能是重要原因.了解该菌的流行状况对监控和治疗MRSA感染具有重要意义.
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医院感染监测中肠球菌的耐药性分析
病原菌引起医院感染已受到临床高度重视,其中又以耐万古霉素的肠球菌(VRE)尤为突出,成为临床治疗棘手的问题.为了解肠球菌临床感染的分布及耐药特点,指导临床合理用药,笔者对临床标本分离的肠球菌进行了菌种鉴定及耐药性检测,分析如下.
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耐万古霉素金黄色葡萄球菌耐药机制及检测方法研究进展
我国是一个耐苯唑西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株发生率极高的国家[1].万古霉素保持了对MRSA很高的活性,目前国内有关耐万古霉素金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)分离株的报道较少.但是某些MRSA菌株由于继续突变或基因转移出现耐万古霉素金葡菌,这将是未来必然要面对的一个严重的临床问题.因此,了解国内外耐万古霉素金葡菌感染现状、耐药机制及实验室检测方法很有必要.
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万古霉素异质性耐药葡萄球菌的分离及其药物敏感性分析
目的调查葡萄球菌对万古霉素异质性耐药亚群发生频率以及对常见抗生素的药物敏感性.方法利用菌群分析法筛选万古霉素异质性耐药葡萄球菌亚群,Microscan Microbiology System对萄萄球菌分型和鉴定并分析对19种常用抗生素的药物敏感性.结果115株耐甲氧西林的葡萄球菌,9株对万古霉素耐药亚群的MIC 8～12mg/L,其发生频率为10-1～10-7,其中3株金葡球菌,6株溶血性葡萄球菌.传至7代后万古霉素MIC 64mg/L.对19种抗生素药敏显示,万古霉素敏感2株、中介7株,敏感率22.2%;利福平敏感7株(MIC≤1mg/L)、中介1株(MIC=2mg/L)及耐药1株(MIC＞2mg/L)、敏感率77.8%;SMZ/TMP敏感6株(MIC≤2/38mg/L)、耐药3株(MIC＞2/38mg/L),敏感率66.7%;克林霉素敏感3株(MIC＝0.5或≤0.25)、耐药6株(MIC＞2mg/L),敏感率33.3%;四环素敏感3株(MIC≤2mg/1)、耐药6株(MIC 8mg/L),敏感率33.3%;左氧氟沙星敏感1株(MIC≤2mg/L)、耐药8株(MIC＞4mg/L),敏感率11.1%.其余13种抗生素耐药.结论下呼吸道分离的葡萄球菌存在一定频率的对万古霉素异质性耐药株,可能是万古霉素刎治疗失败的原因之一,利福平、SMZ/TMP具有较好的敏感性,克林霉素和四环素次之,除了某些新型抗生素外,这些现有的药物可供临床治疗万古霉素异质性耐药葡萄球菌时参考.
