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粪肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立用于检测粪肠球菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法.方法 根据粪肠球菌的d-丙氨酸聚连接酶(ddl)基因设计TaqMan FQPCR的引物及探针,并使用39种常见致病菌和条件致病菌检测其特异性.将目的基因克隆到质粒中,制作标准曲线,确定方法的检测下限.制备血液模拟标本,直接提取核酸进行检测,探索临床应用的可能.结果 在特异性评价实验中,除阳性对照外其余样本均未出现特异性扩增曲线.建立粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法的标准曲线,确定该方法的检测下限为20 copy/管.通过对粪肠球菌血液模拟标本的检测发现,本方法对模拟标本的检测灵敏度为3.9×103cfu/ml.在稳定性评价中,对含菌量为3.9×108、3.9×106和3.9×104cfu/ml的血液模拟标本重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数(CV)为0.99％ ～ 1.84％.结论 本研究建立了适用于临床标本检测的粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法.
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2012-2014年辽宁省大连市某医院分离粪肠球菌耐药性及多位点序列分析
目的 了解大连市某医院2012-2014年住院患者分离粪肠球菌耐药性、携带毒力基因情况和多位点序列分型(MLST)的型别.方法 使用自动化仪器法对分离菌株的耐药性进行鉴定.应用聚合酶链式反应(PCR)方法检测4种常见毒力基因的携带情况.应用MLST对分离菌株进行分型.结果 分离的55株粪肠球菌中耐药菌株比例为92.72％,其中多重耐药菌的比例为65.45％.分离的粪肠球菌对四环素的耐药率高,对红霉素、高浓度庆大霉素和利福平也有较高的耐药率.对青霉素耐药率为7.27％,未发现对糖肽类和脂肽类抗生素耐药的菌株.55株粪肠球菌共有28个MLST型别,其中CC(Clonal complex) 16为优势克隆群,占菌株总数的43.64％.有多株同一克隆群的粪肠球菌具有相似的耐药谱和毒力携带情况.结论 大连市某医院分离到多株属于同一克隆、多重耐药且携带多种毒力基因的粪肠球菌,需要针对优势克隆菌株的特点指导临床用药和院内感染的预防控制.
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粪肠球菌和屎肠球菌的分布及耐药性分析
目的:分析我院2015年临床分离的粪肠球菌和屎肠球菌分布及耐药特点.方法:收集我院2015年1月至2015年12月的临床送检标本,采取法国制造的VITET2-compact对分离株进行鉴定与药敏检测.结果:分离出73株屎肠球菌,117株粪肠球菌;科室分布以泌尿外科、重症医学科、肾内科居多;药敏检测结果显示利奈唑胺、替加环素、万古霉素对两类菌株效果好,克林霉素、红霉素效果差,但是两类菌株对肠球菌的常用药物存在显著的差异,P＜0.05结论:当出现肠球菌感染情况时,应严格分析抗菌药物的临床应用指征、菌株耐药特点等,便于采取针对性的临床治疗.
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自贡市肉及其制品中粪肠球菌耐药性毒力基因和多位点序列分析
目的 了解四川省自贡市肉及其制品分离粪肠球菌的抗生素耐药性和携带毒力基因情况,以及多重耐药菌株的序列分型(ST).方法 2013年4月17 ～21日对147份肉及其制品样品污染的粪肠球菌进行分离鉴定,使用全自动微生物鉴定仪对分离菌株的耐药性进行检验,应用聚合酶链式反应(PCR)方法检测分离到的粪肠球菌携带4种常见毒力基因的情况,并对多重耐药菌株进行多位点序列分型(MLST)研究.结果 从147份肉及其制品样品中共分离到65株粪肠球菌,其中耐药菌株比例为58.5％(38/65);分离菌株对四环素的耐药率高,为41.5％ (27/65),对利福平、氯霉素和红霉素也均有较高的耐药率;分离菌株对高浓度链霉素和高浓度庆大霉素的耐药率分别达到了15.4％(10/65)和12.3％ (8/65);未分离到对青霉素类(青霉素和氨苄西林)、糖肽类(万古霉素)和脂肽类(达托霉素)抗生素耐药的菌株.4种常见毒力基因(gelE、asa1、esp、cylA)在65株分离株中均有携带,阳性率分别为56.9％(37/65)、21.5％(14/65)、9.2％ (6/65)和7.7％(5/65).14株多重耐药菌株共有9个MLST型别,包括4株ST16、2株ST81和2株ST480菌株,且相同ST型别的粪肠球菌有相似的耐药谱和毒力基因携带情况.结论 四川省自贡市肉及其制品中相同ST型别的粪肠球菌有相似的耐药谱和毒力基因携带情况,应重视肉及其制品中耐药粪肠球菌对公众健康的潜在威胁.
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北京市集贸市场生鲜猪肉肠球菌种水平鉴定及耐药特征
目的 评价和比较不同肠球菌种水平鉴定方法的准确性,了解北京市集贸市场生鲜猪肉肠球菌的种水平分布及耐药特征.方法 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK 2 COMPACT两种方法对北京市集贸市场生鲜猪肉肠球菌开展种水平鉴定,两种方法鉴定结果不一致的菌株使用API 20 Strep、16S rRNA和23S rRNA序列分析再次鉴定.比较不同种肠球菌对10种临床常用抗生素的药物敏感性.结果 在5种肠球菌种水平鉴定方法中,16S rRNA序列分析和终结果的符合率高,为100.0％;VITEK 2 COMPACT符合率低,仅为4.0％ (1/25).在86株肠球菌中,粪肠球菌占82.6％ (71/86),其次为希拉肠球菌占14.0％ (12/86).粪肠球菌对环丙沙星(CIP)的耐药率高于希拉肠球菌,差异有统计学意义(x2=10.751,P＜0.01);对四环素(TET)、高浓度链霉素(HLSR)和高浓度庆大霉素(HLGR)的耐药率均高于希拉肠球菌,但差异无统计学意义(TET:x2=3.865,P＞0.05;HLSR:x2=1.608,P＞0.05;HLGR:x2=0.553,P＞0.05),但对红霉素(ERY)和氟霉素(CHL)的耐药率明显低于希拉肠球菌,差异有统计学意义(ERY:x2=20.244,P＜0.01;CHL:x2=14.139,P＜0.01).结论 16S rRNA和MALDI-TOF-MS序列分析技术在肠球菌种水平快速鉴定上有较高准确性,不同种属肠球菌呈现不同耐药特征,本研究为有效监测食源性耐药肠球菌的传播和流行提供了科学数据.
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难治性根尖周炎根管粪肠球菌的检测与临床症状关系的分析研究
据相关医学统计显示,近年来我国根尖周炎的患病比例较往年有了很大的提高,尽管当前的牙科医学诊疗技术有了很大的发展,但针对患有难治性根尖周炎的患者,仍然没有具有良好疗效的技术方法.本文主要就是为了进一步研究难治性根尖周炎的根管治疗方法而进行研究分析的初期报告,主要分析了感染根管内细菌种类之一的粪肠球菌的检测与临床症状关系,并得出了初步结论,即根尖周炎难以彻底治疗的主要病因仍然是因为细菌感染,而粪肠球菌是主要的一种感染细菌种类.
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粪肠球菌和屎肠球菌的临床分布特点及其耐药性研究
目的 研究医院患者肠球菌感染特点及其耐药性,为临床合理选择抗菌药物提供参考.方法 通过临床病原学标本检测方法,收集和分析某医院患者送检标本粪肠球菌和屎肠球菌检验结果.结果 该医院2013-2014年间,从住院患者送检病原学标本中共分离出屎肠球菌137株和粪肠球菌125株,主要分离自尿液,构成比分别为45.26%和41.60%.临床分离的屎肠球菌对红霉素、氨苄西林和环丙沙星的耐药率均超过80%;而粪肠球菌对氨苄西林和环丙沙星的耐药率均较低.两种肠球菌均对替加环素和万古霉素高度敏感.结论 该医院临床分离的屎肠球菌和粪肠球菌主要来自尿液;两种肠球菌对抗菌药物耐药谱存在差别,提示应加强药敏试验,合理选用抗菌药物.
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四种中药对感染牙本质小管粪肠球菌的抑制作用
目的 比较黄连等4种中药水煎剂对离体人牙根管内粪肠球菌的体外抑菌效果.方法 选取84颗新鲜拔除的人单根管牙,截取6 mm高的柱状牙根.随机分为4个实验组(黄连水煎剂组、五味子水煎剂组、大黄水煎剂组、连翘水煎剂组)和3个对照组[甲醛甲酚(FC)组、阴性对照组和阳性对照组],每组12颗牙.常规根管预备后灭菌制备感染粪肠球菌根管模型,阴性对照组不感染细菌,放置0.9%氯化钠注射液,余每组根管均感染细菌,分别放置上述不同药剂,3天、7天后分别培养并测量细菌的透光度.结果 黄连水煎剂组3天与甲酫甲酚组3天组间无差别(P＞0.05);连翘水煎剂组3天与阳性对照组3天组间无差别(P＞0.05);五味子水煎剂组3天与阴性对照组7天组间无差别(P＞0.05);大黄水煎剂组3天、黄连水煎剂组7天与甲酫甲酚组7天组间无差别(P＞0.05);连翘水煎剂组7天与阳性对照组7天组间无差别(P＞0.05);其余各组间差别均有统计学意义(P＜0.05).结论 四种中药中,黄连、五味子、大黄均有不同程度抑制粪肠球菌的作用,黄连作用强.黄连抑菌作用与FC相同.连翘无抑制粪肠球菌的作用.
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中药水煎剂对粪肠球菌感染根管的体外抑菌试验
目的 评价中药水煎剂对粪肠球菌的体外抑菌效果.方法 选取70 颗新鲜拔除的人单根管牙,截取6mm高的柱状牙根.将牙根随机分为阴性对照组、甲醛甲酚组(FC) 、黄连水煎剂组、大黄水煎剂组、连翘水煎剂组、五味子水煎剂组、阳性对照组,每组10 颗牙根.常规根管预备后灭菌制备感染粪肠球菌根管模型,阴性对照组不感染细菌,放置 0.9%氯化钠注射液,阳性对照组感染细菌,放置 0.9%氯化纳注射液,其余每组根管均感染细菌,分别放置上述不同药剂,培养3d,7d 后分别测量细菌的透光度.结果 大黄3d,黄连7d,FC 7d 无差别;五味子 3d,阴性对照 7d 无差别;黄连 3d,阴性对照 3d 无差别.结论 相同浓度的中药水煎剂对粪肠球菌有不同程度的抑菌活性,黄连水煎剂的作用强,其次是五味子,大黄,连翘作用差.
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五倍子提取物对224株肠球菌的体外抗菌活性观察
目的观察五倍子提取物对肠球菌的体外抗菌活性.方法采用新的中药抑菌实验方法对五倍子提取物进行224株肠球菌的低抑菌浓度测定.结果五倍子提取物对169株耐粪肠球菌(enterococcus faecalis)和51株屎肠球菌(enterococcus faecium)的MIC50、MIC90分别为0.072、0.072 mg/mL和0.288、0.575 mg/mL.结论五倍子提取物对224株肠球菌具有较强的抑菌力,说明五倍子是极具开发前景的抗感染中药.
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五倍子乙醇提取物对140株肠球菌体外抗菌活性观察
目的观察五倍子乙醇提取物对肠球菌的体外抗菌活性.方法采用新的中药抑菌实验方法对五倍子乙醇提取物进行140株肠球菌的低抑菌浓度测定.结果五倍子乙醇提取物对93株粪肠球菌、40株屎肠球菌和7株其它肠球菌的MIC90分别为0.315、0.63、0.63mg/mL.结论五倍子乙醇提取物对140株肠球菌具有较强的抑菌力,说明五倍子是极具开发前景的抗感染中药.
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临床分离屎肠球菌和粪肠球菌敏感性对比分析
目的 了解医院临床分离的145株屎肠球菌和86株粪肠球菌的耐药性.方法 采用法国梅里埃公司的VITEK2COMPACT全自动微生物分析仪对菌株进行鉴定和抗菌药物敏感性检测.结果 屎肠球菌和粪肠球菌主要来源于尿液(48.92％),其次为血液(12.99％).屎肠球菌和粪肠球菌对万古霉素、利奈唑烷和替加环素的敏感率均为100％;屎肠球菌除对喹奴普汀/达福普汀和四环素的敏感率显著高于粪肠球菌外,对呋喃妥因、氨苄西林、青霉素G、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星的敏感率均显著低于粪肠球菌.结论 屎肠球菌和粪肠球菌对抗菌药物的敏感性存在差异,临床应根据抗菌药物敏感性特征结合种间耐药性差异制定治疗方案.目前万古霉素、利奈唑烷,替加环素为治疗屎肠球菌和粪肠球菌感染的有效抗菌药物.
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两株牛源致病性肠球菌的分离鉴定及生物学特性分析
目的 分离、鉴定宁夏地区某养殖场致奶牛和肉牛死亡的病原菌,并分析其生物学特性. 方法 采集宁夏地区一奶牛和肉牛养殖场死亡犊牛脏器,进行病原菌的分离培养,采用革兰染色、全自动生化鉴定仪进行菌种鉴定,并进行生物学特性分析,包括培养特性、药物敏感性、毒力基因携带情况以及动物致病性. 结果 分离纯化得到两株革兰染色阳性菌,分别命名为EF1和EF2,在营养培养基上形成白色、圆形、光滑的菌落,在选择性培养基上形成黑色、圆形、光滑菌落.经全自动生化鉴定仪鉴定EF1为屎肠球菌(Enterococcus aecium),EF2为粪肠球菌(Enterococcus aecalis);药敏试验测定EF1对头孢拉定、庆大霉素和丁胺卡那耐药,EF2对头孢拉定、林可霉素、环丙沙星、土霉素、庆大霉素、磺胺嘧啶和丁胺卡那耐药.PCR检测EF1携带agg、gelE和efaA毒力基因,EF2携带esp、ace、gelE和efaA毒力基因.动物致病性试验中小鼠注射病原菌72 h开始死亡,解剖观察两组小鼠脏器(肝、脾、肾)均肿大变黑,且从病变脏器中分离到的细菌均与接种细菌一致. 结论 该起疫情病原菌为粪肠球菌和屎肠球菌.两分离菌株均具有高耐药性和强致病性,可能与携带多种毒力基因有关.
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屎肠球菌和粪肠球菌多位点序列分型及耐药相关性研究
目的 研究屎肠球菌和粪肠球菌的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及其应耐药性,为防控院内感染提供基础数据. 方法 收集2013年1月-2016年12月包头地区同一医院来源的粪肠球菌58株和屎肠球菌74株,随机抽取粪肠球菌菌株29株和屎肠球菌菌株37株为实验菌株,采用聚合酶链反应(PCR)法及基因测序技术分别检测粪肠球菌看家基因(gdh、gyd、stS、gki、xpt、aroE、yqiL)和屎肠球菌看家基因(adk,atpA,ddl,gdh,gyd,purK,pstS);将测序结果与相应菌群数据库比较,获得屎肠球菌、粪肠球菌菌株的序列型(STs).采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪及药敏系统鉴定肠球菌并同步测定9种抗菌药物(氨苄西林、青霉素、四环素、红霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、万古霉素、庆大霉素、链霉素)MIC值. 结果 粪肠球菌分离株总分为10个ST型,其中13株等位基因谱相同,为ST179,占44.83％;屎肠球菌分离株分为10个ST型,其中14株等位基因谱相同,为ST78,占40.00％.屎肠球菌对红霉素耐药率高,为100％;粪肠球菌对四环素耐药率高,为72.4％.两类肠球菌均未检出万古霉素耐药分离株.粪肠球菌庆大霉素耐药和链霉素敏感株中ST179均占45.83％,屎肠球菌庆大霉素耐药和链霉素耐药菌中ST78均占34.23％. 结论 屎肠球菌、粪肠球菌的优势菌型分别为ST78和ST179.针对性使用肠球菌优势菌型敏感药物,严格抗生素管理,是提高粪肠球菌感染治愈率,有效控制院内感染的优先措施.
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全基因测序分析粪肠球菌利奈唑胺耐药相关变异位点的研究
目的 通过全基因组序列研究利奈唑胺敏感株和诱导耐药粪肠球菌之间基因位点差异,分析利奈唑胺耐药相关基因变异位点. 方法 粪肠球菌ATCC29212菌株用浓度梯度的利奈唑胺进行耐药性诱导,终获得利奈唑胺耐药的粪肠球菌株LRS29212.提取其总DNA,进行PE(paired end或称双端)测序,采用软件SPAdes进行序列拼接,拼接获得原始scaffold,然后用Gapcloser及GapFiller对scaffold补Gap,采用PrInSeS-G进行序列校正,终获得全基因组序列.获得的全基因序列与标准株ATCC29212菌株基因组序列(PUBMED公布序列)作比较,获得变异基因位点,并对变异基因功能进行注释. 结果 通过32代诱导,获得了粪肠球菌LRS29212,其MIC值为128 μg/ml;粪肠球菌LRS29212全基因组包含3 010 552碱基对,GC含量37.3％.基因组通过注释后总共有2 918个编码序列(CDS),53个tRNA的编码基因,以及5个完整的rRNA基因编码的操纵子,获得PUBMED全基因序列号(PRJNA257022);总共找出152个SNP,其中错义突变的SNP有24个,包含结合糖ABC转运ATP结合蛋白. 结论 经LZD诱导成功获得耐LZD粪肠球菌LRS29212菌株,测序分析该菌株存在基因突变位点,为进一步研究LZD耐药机制奠定了基础.
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利奈唑胺体外诱导粪肠球菌耐药株23S rRNA Ⅴ区基因突变位点分析
目的 阐明体外诱导利奈唑胺耐药粪肠球菌的核糖体23S rRNA Ⅴ区基因位点变异特征. 方法 收集1株血流感染的粪肠球菌和1株粪肠球菌质控菌ATCC29212(编号分别为F3和F4菌株,均为利奈唑胺敏感株),通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增23S rRNA Ⅴ区基因,扩增产物经测序后与野生株比较,获得Ⅴ区的突变位点. 结果 经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值粪肠球菌共13株.PCR测序分析2株母株均无变异位点,23S rRNA Ⅴ区的突变位点主要是G2576U,此外还有T2504A、G2505A、C2610A、C2424U. 结论 体外多步法可诱导粪肠球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与23S rRNA Ⅴ区位点突变密切相关,突变位点随着MIC值的增高而增多.
关键词： 粪肠球菌 利奈唑胺耐药 23S核糖体RNA基因 -
2009～2013年齐齐哈尔市粪肠球菌基因序列进化研究及耐药性分析
目的 研究化脓性胆管炎患者胆汁培养粪肠球菌基因序列,分析其对6种氟喹诺酮类药物的耐药性. 方法 对2009～2013年齐齐哈尔医学院附属三院ERCP治疗的化脓性胆管炎患者胆汁标本分离的60株粪肠球菌进行基因序列分析,并利用琼脂稀释法检测分离菌对6种氟喹诺酮类药物(FQs)的MIC50,MIC90和耐药率. 结果 本组粪肠球菌对6种氟喹诺酮类药物耐药率分别为:莫西沙星1 5.0％,加替沙星18.3％,左氧氟沙星25.0％,氧氟沙星和环丙沙星均为35.0％,诺氟沙星48.3％.粪肠球菌耐药株中的gyrA在喹诺酮类药物耐药决定区的第83位和87位氨基酸发生突变,分别为S83I,E87G.parC第80位氨基酸发生突变S80I,产生对氟喹诺酮类药物耐药. 结论 莫西沙星和加替沙星对粪肠球菌具有良好的抑制作用,但由于部分粪肠球菌菌株基因已发生突变,其耐药性还需进一步观察,同时还需开发更有效的具有抑制此类细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的氟喹诺酮类药物.
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牛乳源粪肠球菌cyla基因的克隆及编码蛋白抗原表位分析
目的 分离鉴定牛乳腺炎乳中的粪肠球菌并克隆其溶血素基因cyla. 方法 从内蒙古科左后旗一奶牛场采集奶牛乳腺炎乳样,进行粪肠球菌的分离、培养,生化试验和分子生物学鉴定及药敏试验;对溶血素基因cyla进行同源性比对并分析其编码蛋白的抗原表位. 结果 从奶牛乳腺炎乳中分离出粪肠球菌cyla基因序列比对及进化分析表明,分离菌与GenBank上公布的粪肠球菌序列(CP015883.1)的同源性达100％,与其处于同一个进化分枝,抗原性分析显示cyla基因编码蛋白具有一定的抗原表位区域.该菌具有溶血特性,对氨苄西林、万古霉素敏感,对四环素耐药. 结论 牛乳腺炎粪肠球菌cyla基因编码蛋白具有抗原表位,可作为粪肠球菌致奶牛乳腺炎防控疫苗研发的靶标抗原.
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红霉素耐药粪肠球菌耐药基因erm(A)、erm(B)和erm(C)分布及耐药性分析
目的 了解临床分离株红霉素耐药粪肠球菌耐药特点及耐药基因erm(A)、erm(B)和erm(C)分布特点及耐药机制. 方法 采用BD Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统对2010～2016年临床分离的313株粪肠球菌进行药敏试验,并用微量肉汤稀释法检测红霉素的MIC值,比较红霉素耐药组和红霉素敏感组细菌的耐药性差异,使用PCR方法检测erm(A)、erm(B)和erm(C)基因并分析其分布特点. 结果 313株粪肠球菌主要分离自患者的中段尿、血液、胆汁和分泌物,红霉素耐药组和红霉素敏感组细菌对万古霉素、利奈唑胺、氨苄西林、替考拉宁和呋喃妥因的敏感性高,对庆大霉素的耐药率均＞90％.红霉素耐药基因erm(A)、erm(B)和erm(C)基因检出比例分别为3.51％、66.77％和 0.32％;携带红霉素耐药基因erm(A)细菌利奈唑胺(LZD)耐药为81.82％.粪肠球菌对红霉素耐药率为76.04％.结论 红霉素耐药株粪肠球菌主要携带erm(B)基因.红霉素耐药基因erm(A)阳性菌株LZD的MIC值偏高.
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粪肠球菌主要毒力因子研究进展
粪肠球菌为条件性致病菌,是许多国家医院内感染的主要病原菌,也是一种新的人畜共患病病原体.粪肠球菌感染和致死主要是由其毒力因子引起的,本文概述了粪肠球菌主要毒力因子尤其是溶血素的研究进展,为粪肠球菌致病机制的研究奠定基础.
