首页 > 文献资料
-
破伤风类毒素原液质量分析方法的研究
目的：建立对破伤风类毒素原液进行质量分析的分子排阻色谱方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。方法分别建立分子排阻色谱方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对破伤风类毒素原液单体和聚体含量进行分析，并对两种方法的关键影响因素及两种方法检测结果进行评价分析。结果以含1%异丙醇的 pH 7.0，0.2 mol/L磷酸盐缓冲液为流动相，选取 TSK-GEL G3000SWxl色谱柱，可以对破伤风类毒素单体、二聚体和多聚体分离，经配套软件分析得到其三个组分的相对含量；选用实验室自配的10%浓度的分离胶对破伤风类毒素原液进行电泳后经 Image Lab软件分析可以对破伤风类毒素原液的单体和聚体进行纯度分析，两种方法检测结果具有可比性。结论建立的两种检测破伤风类毒素原液单体和聚体含量的方法能够对所含单体、二聚体和多聚体进行分离和定量，两种方法相辅相成，可以对生产的破伤风类毒素原液批间一致性进行监控和用于不同目的的破伤风类毒素质量情况进行监督。
-
重组人源化单克隆抗体rhumAb1分子大小变异体的研究
利用分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、非还原毛细管电泳(CE-SDS)并结合液质联用(LC-MS)、抗体依赖细胞介导的细胞毒活性检测(ADCC)等技术对重组人源化单克隆抗体(rhumAb1)在高温(40℃)条件下产生的分子大小变异体进行研究.本研究鉴定了rhumAb1在SEC-HPLC分析中的4个分子大小变异体(SEC-1～SEC-4)和非还原CE-SDS中的7个主要变异体(NR-1～NR-7)的组成和结构.发现主要的低分子量变异体(片段)是由于重链的铰链区断裂所致,断裂位于铰链的Ser221-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys228区域,其中C222-D223和H226-T227为主要断裂位点.ADCC活性检测表明,rhumAb1分子大小变异体(二聚体和片段)显著降低了产品的活性.该研究为rhumAb1产品的质量标准和相应的质控策略的制定奠定了基础,也为其他抗体药物的质量控制提供了参考.
-
中药注射剂中大分子物质筛查方法研究
目的 建立分子排阻色谱法测定中药注射剂中大分子物质,用于中药注射剂中大分子物质的筛查.方法 运用分子排阻色谱法,分别采用紫外检测器和示差检测器进行检测.以Phenomenon BioSep-SEC-s2000(7.8 mm×300 mm,8μm)为色谱柱,以右旋糖酐为对照品时,以0.05 mol·L-1 Na2SO4为流动相,示差检测器检测;以蛋白质为对照品时,以0.1％三氟乙酸-乙腈(70∶ 30)为流动相,用紫外检测器,波长为214 nm.结果 在示差检测器条件下,右旋糖酐对照品相对分子质量在7 100～133 800内线性关系良好,检测限为0.097 9 μg,精密度和稳定性均良好,RSD均在0.4％内;胸腺素相对分子质量分布对照品相对分子质量在1 638 ～ 13 700内线性关系良好,检测限为0.003 58 μg,精密度和稳定性良好,RSD均在0.2％内.选择的几种中药注射剂均未检出大分子物质.结论 建立的方法可用于中药注射剂大分子物质初步检查.
-
超高效液相色谱法测定人血白蛋白分子大小分布方法的建立
目的 建立人血白蛋白(human serum albumin,HSA)产品分子大小分布(多聚体含量)的超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography,UPLC)分析测定方法.方法 采用Waters ACQUITYUPLC系统、Waters TUV紫外检测器、ACQUITY UPLC PROTEIN BEH SEC色谱柱,以磷酸盐缓冲液作为流动相、0.6 mL·min-1流速、TUV紫外280 nm测定人血白蛋白分子大小分布.稀释制备不同质量浓度(0.5～20 mg·mL-1)的HSA样品分析不同进样浓度下其各组分百分含量变化、线性关系等,分子大小分布结果按照面积归一化法计算.在佳进样浓度范围内,选择适宜浓度稀释人血白蛋白国家参考品并用UPLC测定进行方法学确认.用UPLC和HPLC方法扩展测定20批人血白蛋白样品,进行方法一致性比对和再确认.结果 UPLC测定人血白蛋白多聚体保留时间为1.469 min,二聚体保留时间为1.972 min,单体峰保留时间为2.267 min.二聚体与单体分离度为2.20,单体峰拖尾因子1.18.11个进样质量浓度条件下(0.5～20 mg·mL-1)人血白蛋白样品各组分包括多聚体、二聚体、单体峰的峰高及峰面积与进样浓度之间均呈良好线性关系,线性相关系数平方均大于0.997 0;不同浓度下多聚体峰面积百分比相对标准偏差RSD分别为0(n =3,10 mg·mL-1)和0.10％ (n =3,12 mg·mL-1)和0.10％ (n =3,16mg· mL-1);人血白蛋白样品在10～16 mg·mL-1(上样总量100～160 μg)内各组分峰面积百分比及与进样浓度的线性关系均保持相对稳定;HPLC测定人血白蛋白国家参考品多聚体峰面积百分含量为5.58％,UPLC平行测定该国家参考品多聚体含量均值为5.62％ (n=10),两者一致且结果均符合国家参考品的质量控制范围;UPLC测定人血白蛋白国家参考品多聚体峰面积百分比RSD为0.40％(n=10);HPLC与UPLC方法平行测定的20批来自国内外7家企业的人血白蛋白样品(12mg·mL-1下)多聚体峰面积百分含量结果证实2种方法无显著性差异(P＞0.05),2种方法的相关系数为0.996 0 (n =20).结论 UPLC测定人血白蛋白产品的多聚体含量准确性和重复性良好,相比于传统HPLC方法新建UPLC方法大幅节省分析时间,更为准确、快速、简便,可实现高通量的人血白蛋白分子大小分布测定.
-
抗体偶联药物抗CD30-vc-MMAE的异质性分析
目的 建立一种基于半胱氨酸偶联方式的抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADCs)抗CD30-vc-MMAE异质性分析的质控方法.方法 本实验应用了分子排阻色谱(SEC-HPLC)、毛细管电泳(CE-SDS)以及实时成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)等分析方法,对抗体偶联药物抗CD30-vc-MMAE的大小异质性和电荷异质性进行了分析.结果 SEC-HPLC分析的纯度为(95.69±0.01)％;还原CE-SDS分析的纯度为(98.38±0.25)％,非还原CE-SDS可分离开6个主要峰,纯度之和为(97.82±0.44)％;和裸抗药物类似,iCIEF可有效的将酸区,碱区和主峰抗体进行较好地分离,主峰区的峰面积百分比为(43.52±2.03)％.结论 初步建立了一种基于半胱氨酸偶联方式的ADC药物抗CD30-vc-MMAE异质性分析的质控方法,为此类生物制品的质量控制提供参考.
-
注射用头孢美唑钠高分子聚合物检查方法的建立与验证
目的:建立注射用头孢美唑钠中高分子聚合物分离分析的质量控制方法.方法:采用分子排阻色谱法,色谱柱为Sephadex G-10(300 mm×10 mm,40 ～ 120 μm),流动相A为0.075 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0),流动相B为水;流速为1.5 ml/min,检测波长为280 nm,进样量为100μl,采用自身对照外标法定量.结果:在2.897 ～ 144.9 μg/ml范围内样品浓度与聚合物峰面积呈良好线性关系(r=1.000 0),检出限29 ng.结论:该方法快速、简便、准确、重复性好,适用于注射头孢美唑钠中高分子聚合物的分析.
-
腐食酪螨过敏原的分析鉴定与纯化
目的 分析、鉴定与纯化腐食酪螨过敏原组分.方法 以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定腐食酪螨蛋白质提取液中的蛋白质组分和过敏原组分,并通过阴离子交换层析和分子排阻色谱进一步纯化.结果 腐食酪螨的蛋白质粗浸液电泳后可以辨认的蛋白质带共23条,相对分子质量(Mr)分别为177 000、118 000、107 000、70 000、67 000、60 000、52 000、45 000、41 000、40 000、38 000、37 000、35 000、27 000、23 000、22 000、18 000、17 000、16 000、15 000、14 000、13 000和12000.Western blotting分析显示,腐食酪螨的5条致敏蛋白质带分别为Mr128 000、67 000～70 000、36 000～37 000、18 000和16 000,其中前3条带特异性结合IgE阳性率均为100%,而Mr 18 000和Mr 16 000条带的阳性反应率分别为77.8%和44.44%.通过阴离子交换层析和分子排阻色谱从腐食酪螨粗浸液中分离到Mr18 000的过敏原组分.结论 腐食酪螨有4种主要过敏原及1种次要过敏原.
-
脑蛋白水解物片剂肽含量测定方法的改进
目的：优化脑蛋白水解物片中肽含量测定方法。方法：采用分子排阻色谱法鉴别脑蛋白水解物片中小分子肽类、高效液相色谱法测定脑蛋白水解物片中肽含量。结果：分子排阻色谱法鉴别小分子肽特异性强；高效液相色谱法测定的各种氨基酸在一定的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＞0.999），平均回收率为98.0%～102.4%。结论：该方法快速、简便、专属性强、重复性好，结果准确可靠，适用于脑蛋白水解物片的质量控制。
-
SEC-MALLS法测定多糖相对分子量的不确定度分析
分别采用分子排阻色谱(SEC)法及其与多角度激光光散射法(SEC-MALLS)联用测定普鲁兰糖的相对分子量(Mw).SEC法采用示差检测器(RI),SEC-MALLS法为MALLS与RI联用.采用t检验比较2种方法的分析结果,结果显示SEC-MALLS与SEC法测定结果一致.分别分析和评定这2种方法的不确定度,计算测定过程中的不确定度分量、合成不确定度和扩展不确定度.结果表明SEC-MALLS法稳定可靠,可替代SEC法.
-
一种新型长效胰岛素类似物的结构一致性研究
研究一种新型长效胰岛素类似物自制制剂与原研制剂中双六聚体结构的一致性.采用圆二色谱法、分子排阻色谱法、多角度激光法、差示扫描量热法及动态光散射法进行研究.圆二色谱法分析结果显示,远紫外区和近紫外区的圆二色谱图一致,α-螺旋、β-折叠、转角和无规则卷曲4种结构的比例无明显差异;分子排阻色谱法中,自制制剂与原研制剂主峰出峰时间一致,两制剂均只存在一种聚集形态;多角度激光法测得自制制剂和原研制剂的聚合度分别为12.2±0.21和12.6±0.05;差示扫描量热法中,自制制剂与原研制剂在△H、T1/2 、TMOnest、Tm值等热稳定性参数上基本一致;自制制剂和原研制剂通过动态光散射法检测的平均粒径分别为(1.73±0.24)nm和(1.72±0.17)nm.研究结果表明这种新型长效胰岛素类似物自制制剂与原研制剂表现出良好的结构一致性.
-
分子排阻色谱法测定螺旋藻多糖纯度和分子质量
使用分子排阻色谱法,用已知平均分子质量的硫酸化葡聚糖作为标准,分别用5种不同的流动相,在Shodex Sugar KS柱上测定螺旋藻多糖的纯度以及分子质量,使用线性回归得出校正曲线.并且通过对结果进行多种方法学的考查,选取佳的分析条件.
-
法罗培南中高分子聚合物含量测定方法的建立
目的 用分子排阻色谱法,建立方便快捷的法罗培南中高分子聚合物含量的检测方法.方法 采用葡聚糖凝胶G-10柱,用0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液作为流动相A,以水为流动相B,流速2.0 mL·min-1,检测波长为254 nm.结果 法罗培南在0.102 1~5.100 5 μg范围内有良好的线性关系,相关系数达到0.999.结论该方法灵敏快速,操作简便,重复性好,可用于法罗培南的质量控制.
-
注射用丹参分子排阻色谱及指纹图谱差减分析
目的 探讨注射用丹参质量差异的分析方法.方法 取临床不良反应有差异的不同批号的样品进行平行比对试验,分别应用凝胶分子排阻色谱、碳十八反相液相色谱进行指纹图谱分析,通过综合差减分析揭示非小分子酚酸类成分信息.结果 注射用丹参的凝胶分子排阻色谱有显著的批间差异,非小分子酚酸类成分批间差异显著,与豚鼠急性毒性反应程度相对应.结论 非小分子酚酸类成分应作为丹参系列注射剂质量控制的重点.提出谱毒学研究是中药注射剂安全性研究的重要方向之一.
-
分子排阻色谱法测定头孢克洛胶囊中高分子杂质的含量
目的 建立分子排阻色谱法测定头孢克洛胶囊中的高分子杂质.方法 采用球状亲水硅胶柱(TSK-GEL(R)G2500PWXL 色谱柱,7.8mm×300mm,7μm),流动相为磷酸盐缓冲液(pH7.0)[0.02mol/Lr酸氢二钠溶液和0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)为流动相,流速为0.8mL/min,检测波长为265nm,以头孢克洛对照品外标法计算高分子杂质的含量.结果 头孢克洛在0.532～21.280μg/mL的浓度范围内,面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.9999);小检出浓度为0.161μg/mL;高分子杂质与头孢克洛峰能有效分离,并先于主峰流出,方法专属性良好.结论 该方法适于测定头孢克洛胶囊中高分子杂质,灵敏度高,重复性好,操作简便.
-
分子排阻色谱法测定头孢克肟干混悬剂中高分子杂质的含量
目的 采用分子排阻色谱法检查头孢克肟干混悬剂中的高分子杂质.方法 色谱柱为TSK-GEL(R)G2500PWXL色谱柱(7.8mm×300mm,7μm),流动相为磷酸盐缓冲液(pH7.0)[0.05mol/L磷酸氢二钠溶液和0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)],流速为0.33mL/min,检测波长为254nm,以头孢克肟对照品外标法计算高分子杂质的含量.结果 头孢克肟在2.0～2000μg/mL的浓度范围内,面积与浓度呈良好的线性关系(r=0.9996);小检出浓度为0.7μg/mL;高分子杂质与头孢克肟峰能有效分离,并先于主峰流出,方法专属性良好;高分子杂质在溶液中不稳定,样品需要临用现配.结论 建立的方法快速准确,适用于头孢克肟干混悬剂高分子杂质的测定.
-
晶状体蛋白促大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长的体外研究
目的 探讨晶状体内各主要可溶性晶状体蛋白对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)存活和突起生长的作用,为视神经损伤后再生的研究提供新的思路. 方法 采用分子排阻凝胶色谱法分离纯化晶状体中各主要可溶性晶状体蛋白——α、β-H、β-L、γ晶状体蛋白,再通过SDS-PAGE电泳、肽质量指纹图谱方法鉴定其为目的 蛋白质后,按组分别进行RGCs离体培养试验,观察RGCs的长突起长度和存活细胞数. 结果 RGCs的长突起长度6 d时达大值,分别为:对照组(92.27±35.93)μm,α晶状体蛋白组(181.59±43.78)μm,β-H晶状体蛋白组(123.33±52.81)μm,β-L晶状体蛋白组(89.55±22.40)μm,γ晶状体蛋白组(86.01±39.15)μm.6 d时,各组RGCs存活细胞数分别为:对照组(9.80±3.25)个/视野,α晶状体蛋白组(13.00±4.25)个/视野,β-H晶状体蛋白组(11.33±6.28)个/视野,β-L晶状体蛋白组(8.10±1.83)个/视野,γ晶状体蛋白组(5.74±2.82)个/视野.α、β-H晶状体蛋白组RGCs的长突起长度和存活细胞数明显高于对照组,α晶状体蛋白组作用更明显,β-L晶状体蛋白组与对照组比较,差异无统计学意义,γ晶状体蛋白组存活细胞数在6 d时明显少于对照组. 结论 α晶状体蛋白有明显的促进体外培养的RGCs存活和突起生长的作用,是一种晶状体源性神经保护物质.β-H晶状体蛋白也有一定的促RGCs突起生长和保护存活的作用.γ晶状体蛋白有一定的抑制RGCs存活的作用.
-
分子排阻色谱法测定注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠中的高分子杂质
目的:建立测定注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠(3:1)中高分子杂质的方法.方法:采用Superdex peptide 10/300 GL凝胶色谱柱,以pH 7.0的磷酸盐缓冲液[0.025 mol·L~(-1)磷酸氢二钠溶液-0.025 mol·L~(-1)磷酸二氧钠溶液(61:39)]-乙腈(70:30)为流动相,流速1 mL·min~(-1),检测波长254 nm,主成分自身对照法定量.结果:头孢呋辛高分子杂质与头孢呋辛能较好分离,高分子杂质在进样量为含头孢呋辛50-100μg范围内线性关系良好(r=0.9991),重复性较好(RSI)＝0.88%,n=5).结论:所用方法简便,结果可靠,可以用于注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠(3:1)中高分子杂质的检测.
-
SEC-MALLS法测定普鲁兰糖相对分子质量及分子质量分布
目的:建立分子排阻色谱-多角度激光散射(size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering,SEC-MALLS)系统测定普鲁兰糖的相对分子质量及分子质量分布的方法.方法:采用2根Shodex SB-806HQ色谱柱(300 mm×7.8 mm,10μm)串联,以水为流动相,流速0.5 mL· min-1,柱温35℃,检测器为多角度激光散射器(MALLS)和示差折光检测器(refractiveintexdetector,RID)联用,对普鲁兰糖的相对分子质量及分子质量分布进行测定,并对均方根旋转半径(rg)与样品在溶液中的聚集态进行分析;同时还以传统凝胶渗透色谱(GPC)法对普鲁兰糖的相对分子质量及分子质量分布进行测定,并对2种方法测定的结果进行分析比较.结果:SEC-MALLS法测定普鲁兰糖样品的结果与GPC法测定的结果比较,2种系统测定的重均相对分子质量及分子质量分布结果基本一致,同时测得普鲁兰糖在水溶液中为无规线团构象的线性聚合物.结论:SEC-MALLS法测定相对分子质量无需分子量标样,可以同时获得样品在溶液中的聚集态和构象信息,可用于普鲁兰糖的质量控制.
-
丹红注射液大分子物质筛查方法研究
目的:采用高效分子排阻色谱法(HPSEC法)对丹红注射液中大分子物质进行筛查.方法:采用HPSEC-RID技术,色谱柱为Shodex OHPak SB-803HQ凝胶色谱柱(6.8 mm×300 mm,10 μm),以0.71％硫酸钠水溶液(内含0.02％叠氮钠)为流动相,系列分子量右旋糖酐标准品为对照,对丹红注射液及其中间体中多糖类大分子物质进行筛查;再采用HPSEC-UV技术,色谱柱为TSK-GEL G2000 SWXL凝胶柱(7.8 mm×300 mm,10 μm),以乙腈-水-三氟乙酸(45∶55∶0.05)为流动相,核糖核酸酶A、人胰岛素、胸腺肽α1为对照,在214 nm波长处对丹红注射液及其中间体中蛋白质类大分子物质进行筛查.结果:丹红注射液未检出大分子物质,中间体检出相对分子质量在4 500～9 000的大分子糖类物,说明经过生产过程的逐步除杂,大分子物质在丹红注射液成品中已完全去除.结论:该方法对丹红注射液质量控制具有重要意义,对其他注射液中大分子杂质的检查亦有借鉴作用.
-
完整蛋白分子筛色谱串联质谱测定药物抗体偶联比
目的:建立完整蛋白分子筛色谱串联质谱分析方法对一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物(ADC)的药物抗体偶联比(DAR)进行测定.方法:采用PolyLC PHEA色谱柱,利用pH为7.0的200mmol· L-1乙酸铵溶液为流动相对脱糖样品进行脱盐,通过串联质谱对含有不同数目药物的ADC组分进行测定.结果:所测定的DAR为4.16±0.10,相对标准差为2.40％,且均能显示合不同数目药物的ADC组分的相对比例.结论:完整蛋白分子筛色谱串联质谱分析可确定ADC中含不同数目药物的组分并对各组分进行定量,可用于基于半胱氨酸偶联的ADC的DAR分析.
