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DNA甲基化检测方法及其在肿瘤研究中的应用
DNA甲基化是表遗传改变的主要作用方式,在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育和基因印迹等方面起着重要的作用[1].
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SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立
近期,表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多[1-2].DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,并已成为肿瘤早期诊断的研究热点.甲基化特异性PCR(MSP)是检测DNA甲基化的常用方法之一[3],该方法灵敏度和特异度高,但操作繁琐,难以自动化.TaqMan荧光定量PCR法,即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针,该方法的准确性和检测的灵敏度都很高.然而,因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限[4],而且TaqMan探针昂贵[5].本研究建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(FQ-PCR)检测DNA甲基化的方法,通过临床标本检测和对比试验,以证明其与Methylight的检测效能,以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具.
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半巢式MSP在急性白血病患者p15基因甲基化检测中的应用
传统的观点认为,基因的缺失和突变是基因失活的主要方式,近研究显示,基因异常甲基化所导致的基因沉默亦是基因失活的方式之一.在多种恶性血液病中,p15基因发生异常的主要途径是基因异常甲基化和缺失.目前国内文献上p15基因甲基化的检测方法主要集中在甲基化敏感限制性酶切和Herman等[1]总结的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法.我们通过优化MSP方法,设计了p15基因的半巢式-MSP(Hn-MSP)引物对85例急性白血病(AL)患者进行了p15甲基化状态的检测.
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多重连接依赖性探针扩增技术及其在临床中的应用
多重连接依赖性探针扩增(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification,MLPA)技术是一种高效、特异、快速、简便,针对待检核苷酸序列进行定性和相对定量分析的技术.2002年Schouten等[1]在多重扩增探针杂交(Multiplex amplifiable probe hybridisation,MAPH)技术基础上进行改进而建立了MLPA技术.该技术在一次性反应中可检测45个核苷酸序列拷贝数的改变,目前已广泛应用于染色体数目异常、基因缺失/重复、DNA甲基化检测等多个分子生物学诊断领域.
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急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析
近年研究发现肿瘤细胞中存在DNA甲基化分布异常.即在肿瘤细胞中同时还存在基因组某些区域,特别是在一些抑癌基因的启动子区域高甲基化现象.抑癌基因启动子及转录起始区高甲基化可能也是导致抑癌基因失活和细胞恶性转化的机制之一[1].抑癌基因p15(CDK2B)和p16(CDK2A)均位于人类9号染色体短臂(9p21),编码两种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制性蛋白,参与细胞增殖与分化的调节[2,3].为探讨p15与p16在白血病细胞的甲基化状态及与表达水平的关系,我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测40例初诊急性白血病(AL)患者p15和p16甲基化状态,同时用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测p15和p16基因mRNA表达水平.
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血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的意义
目的 本文将对肺癌患者给予临床分析,从而探讨血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断的临床意义,为提高肺癌疾病的诊断率从而使患者得到及时治疗以及提高患者生活与生存质量提供可靠临床依据.方法 研究组为肺癌患者,对照组一为肺部良性肿瘤患者以及对照组二健康人群分别进行血浆中APC基因甲基化检测,观察并记录三组人群检测结果,进行统计学分析,得出结论.结果 研究组肺癌患者体内血浆中APC基因甲基化阳性率为100.00%,明显高于对照组一的3.23%以及对照组二的0.00%,且P<0.05,三组人群对比结果具有统计学意义.结论 对患者进行血浆中APC基因甲基化检测,能够根据患者检测结果,较为准确的判断患者是否患有肺癌疾病,使患者及时进行治疗,并制定具有针对性的治疗方案,从而提高患者治疗效果,提高患者生活质量与生存率.
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食管癌患者血清中RAS相关区域家族1A基因甲基化检测及其临床意义
食管癌是常见的恶性肿瘤之一.早期诊断可使患者获得及时手术根治的机会.检测患者外周血肿瘤特异性DNA改变为肿瘤早期诊断和监控提供一种有效手段.我们应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法,检测食管癌患者血清中RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因的甲基化状况,探讨其与食管癌临床病理特征的关系及其在食管癌诊断和预后判断中的价值.
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粪便DNA中联合SFRP1及SEPT9基因甲基化检测对老年性结直肠癌早期诊断的临床研究
目的探讨粪便DNA中联合分泌型卷曲相关蛋白1(SFRPl)及胞裂蛋白9(SEPT9)基因甲基化检测对老年性结直肠癌(CRC)早期诊断的临床价值.方法选取我院从2016年1月至2016年9月确诊的35例年龄>60岁CRC患者为研究组,选取同期35例>60岁正常体检者为对照组.提取CRC患者和正常体检者粪便DNA,采用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测SFRP1及SEPT9基因的甲基化状态;比较CRC患者单基因和联合双基因甲基化检出率的差异,以及CRC患者联合双基因甲基化检出率与对照组的差异;分析CRC患者SFRP1或SEPT9基因甲基化与临床病理特征(如年龄、性别、肿瘤位置)的关系.结果CRC患者粪便DNA中SFRP1及SEPT9基因甲基化检出率分别为45.71%(16/35)和51.43%(18/35),均显著高于对照组的8.57%(3/35)和14.29%(5/35),差异均有统计学意义(P<0.01);联合双基因检测结果显示,82.86%(29/35)的CRC患者粪便DNA中至少存在一个基因的甲基化,显著高于单基因检出率(P<0.01),亦高于对照组的17.14%(6/35),差异有统计学意义(P<0.01).CRC患者SFRP1或SEPT9基因甲基化与年龄、性别、肿瘤位置均无关(P>0.05).结论粪便DNA中联合SFRP1及SEPT9基因甲基化检测比单基因检测更加敏感,对老年性CRC早期诊断具有重要的应用价值.
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DNA甲基化的生物学意义及其检测方法
DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制,参与细胞分化与增殖、生物体老化、肿瘤发生等多种重要生命活动.文章简要叙述了DNA甲基化异常的病理学意义,分类介绍了目前主要的甲基化检测方法.希望对相关领域的研究有所助益.
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甲基化特异性PCR技术优化试验
目的 建立一种高特异性的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法.方法 以P15基因为目的基因,以经亚硫酸氢盐转化的全甲基化人类基因组DNA及亚硫酸氢盐转化的全非甲基化人类基因组DNA为模版,采用Methprimer软件预测p15启动子甲基化岛并设计甲基化及非甲基化引物,对甲基化及非甲基化DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR).根据MSP的PCR阶段的退火温度分为普通温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为58、55℃)及提高温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为60、57 ℃).在普通温度组的基础上,通过增加镁离子(Mg2+)浓度、添加PCR反应体系中二甲基亚砜(DMSO)以优化PCR反应体系.结果 MSP的PCR反应阶段,普通温度组出现了非特异性扩增产物,即假阳性及假阴性;提高温度组非特异性扩增减弱,特异性扩增同等降低.普通温度的优化PCR体系组非特异性扩增消失,可以完全消除假阴性及假阳性.结论 设置普通退火温度同时适当地增加Mg2+浓度及DMSO有利于保证MSP结果的特异性.
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甲基化特异性PCR的评价与优化
目的 探讨甲基化特异性PCR(MSP)在DNA甲基化检测中的应用价值.方法 以SHH基因启动子区全甲基化克隆和全非甲基化克隆(质粒)为模板,评价MSP的敏感性和特异性.结果 MSP能检测出样本中低含量的甲基化DNA模板,提高MSP退火温度能克服假阳性或假阴性结果 的产生.结论 MSP检测甲基化具有高灵敏度的优点,适当提高退火温度能保证MSP结果 的特异性.
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胸部低剂量CT联合血清P16基因甲基化检测对肺癌早期诊断的临床研究
肺癌高居我国肿瘤相关死亡的首位.其早期常无特异症状,绝大多数患者临床诊断时已属晚期,50%以上的患者失去手术机会[1],故5年生存率甚低.如何提高早期诊断率是当前降低疾病相关死亡率的关键所在.
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2003年全国主要医学期刊肛肠文献题录
jiancha zhenduan检查诊断代建德等.女婴直肠外阴瘘误治25例分析.中国误诊学杂志,2003,3(4):531.程苏琴等.大肠癌肿瘤组织中p16基因异常甲基化检测.解放军医学杂志,2003,28(7):616.