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粪便DNA中X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子甲基化状态在结直肠癌筛查中的应用研究
目的 以粪便DNA中X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子(XAF)1基因启动子区域的甲基化状态为靶目标,建立新的有效的筛查结直肠癌的方法.方法 收集需做肠镜检查患者自然排泄粪便,经肠镜或病理学检查确诊后,分为3组,结直肠正常组45例,结直肠腺瘤组30例,结直肠腺癌组24例.使用QIAamp DNA Stool MiniKit自粪便抽提人DNA.应用甲基化特异性的PCR(MSP)检测粪便DNA中XAF1基因启动子区域甲基化状态.结果 经genomic-DNA PCR,证实所提取DNA均含有人基因组DNA.经MSP检测,正常组存在高甲基化15例,阳性率33.33％；腺瘤组18例,阳性率60.00％;腺癌组15例,阳性率62.50％,腺瘤组、腺癌组与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05),但腺瘤组与腺癌组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 使用Qiagen试剂盒抽提粪便中人DNA的方法比较稳定.以粪便DNA中XAF1基因启动子区域甲基化状态为靶目标进行结直肠肿瘤的早期诊断,敏感度、特异度较高,但尚需要大样本研究进一步验证.
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粪便DNA检测筛查大肠癌的进展
大肠癌的发生发展是一个多基因作用的多阶段过程,主要涉及的基因包括APC、K-Ras、p53、DCC、BAT26等.粪便DNA检测筛查大肠癌是20世纪90年代出现的一种新方法,具有非侵入性、患者依从性好、敏感性和特异性高等优点.经过十几年的发展,粪便DNA检测已由早期的单基因检测发展到多基因联合检测,检出率也有较大的提高.随着分子生物学技术的日臻完善,粪便DNA检测显现出巨大潜力,为大肠癌的筛查开拓了更广阔的空间.
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APC、p53、K－ras在结直肠肿瘤检测中的研究价值
目的：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ PCR－SSCP）银染法检测腺瘤多发性息肉病（ APC）、p53、K－ras三个基因在结直肠肿瘤筛查中的敏感性和特异性。方法选择2011年11月至2012年8月惠州市第一人民医院消化门诊收治的14例结直肠癌（ CRC 组），60例结直肠腺瘤（ CRA组），30例正常组粪便标本，提取DNA，PCR－SSCP银染法检测基因突变。结果 APC、p53、K－ras三个基因联合检测在CRC组、CRA 组、正常组突变率分别为57.1％（8／14）、30.0％（18／60）、3.3％（1／30）；在结直肠肿瘤的灵敏度和特异度分别为35.1％（26／74）、96.7％（29／30），粪便 DNA 联合检测CRC组、CRA组的检出率高于正常组（均P＜0.05）。结论粪便DNA联合检测在无创性筛查结直肠肿瘤中具有可行性，可能是一种适合于结直肠肿瘤筛查的无创性方法和筛查模式。
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粪便DNA亚硫酸盐快速处理方法的探讨
目的 探讨从微量的粪便中运用亚硫酸盐法成功处理DNA甲基化的方法,寻求适宜的亚硫酸盐的浓度以及处理时间.方法 收集我科员工新鲜粪便标本(经胃镜及结肠镜证实无消化道肿瘤),经亚硫酸盐方法处理后,对大肠埃希菌进行PCR检测,检测结果使用ABI310测序仪器进行测序.结果 在终浓度为2.63 mol亚硫酸盐、并经过95℃15min,4℃10 min,75℃60 min处理;2.11 mol亚硫酸盐经过95℃15 min,4℃10 min,75℃165 min处理均能将E.coliDNA的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U).结论 为从粪便中检测人类相关基因甲基化提供了快捷、科学的依据.
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符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA样本贮存条件考察
目的:考察在不同温度下储存时间和反复冻融对粪便中人基因组DNA含量的影响.方法:1.将粪便样本在室温、4℃、-40℃和-70℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取得到粪便DNA,通过实时荧光定量PCR体系对人KRAS基因定量确定人基因组DNA含量,评价粪便样本不同冻存条件对其中人基因组DNA含量的影响.2.将粪便DNA样本在4℃和-40℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,评价粪便DNA样本不同冻存条件下对其中人基因组DNA含量的影响.结果:1).粪便样本常温放置2小时,其中人基因组DNA即发生明显降解(P＜0.01),4℃可保存3天左右,-40℃可保存4周,-70℃可保存3个月以上,粪便反复冻融第3次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P＜0.05).2).粪便DNA4℃可保存3天,-40℃可保存4周,粪便DNA反复冻融第4次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义口(P＜0.05).结论:符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA贮存条件:粪便样本室温收集后尽快保存;短期可处理的粪便样本存放在4℃条件下(3天内);暂无法处理则存于-40℃(1个月内);粪便样本长期保存在-70℃条件下,可保存3个月.
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大肠肿瘤患者粪便和组织中 APC、p53和K －ras 基因突变的研究
目的：研究大肠肿瘤患者粪便和组织中APC、p53和K－ras基因突变情况，探讨粪便DNA检测用于大肠肿瘤诊断和筛查的可行性及临床意义。方法选择2011年11月1日—2012年8月1日在惠州市第一人民医院行机会性筛查的46例大肠癌，60例大肠腺瘤患者和30例正常者的粪便和组织DNA，应用PCR－SSCP方法检测粪便和组织中APC、p53和K－ras基因突变情况。结果大肠癌组（ CRC组）、大肠腺瘤组（CRA组）和正常组粪便APC、p53、K－ras的突变率分别为58．7％（27／46）、65．2％（30／46）和60．9％（28／46），20．0％（12／60）、25．0％（15／60）和23．3％（14／60），3．33％（1／30）、0％（0／30）和0％（0／30），组织突变率分别为63．0％（29／46）、69．6％（32／46）和63．0％（29／46），25．0％（15／60）、26．7％（16／60）和26．7％（16／60），0％（0／30）、0％（0／30）和0％（0／30）。在粪便中均能检测到与肿瘤组织相应的基因突变，大肠癌组和大肠腺瘤组粪便和组织APC、p53和K－ras基因突变率一致性检验结果Kappa值分别为0．818（P＜0．001）、0．901（P＜0．001）和0．862（P＜0．001），0．857（P＜0．001）、0．870（P＜0．001）和0．822（P＜0．001），一致性均极好。结论粪便DNA检测有望成为一种有效的无创的大肠肿瘤早期诊断和筛查方法，可用于机会性筛查。
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粪便DNA中联合SFRP1及SEPT9基因甲基化检测对老年性结直肠癌早期诊断的临床研究
目的探讨粪便DNA中联合分泌型卷曲相关蛋白1(SFRPl)及胞裂蛋白9(SEPT9)基因甲基化检测对老年性结直肠癌(CRC)早期诊断的临床价值.方法选取我院从2016年1月至2016年9月确诊的35例年龄>60岁CRC患者为研究组,选取同期35例>60岁正常体检者为对照组.提取CRC患者和正常体检者粪便DNA,采用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测SFRP1及SEPT9基因的甲基化状态;比较CRC患者单基因和联合双基因甲基化检出率的差异,以及CRC患者联合双基因甲基化检出率与对照组的差异;分析CRC患者SFRP1或SEPT9基因甲基化与临床病理特征(如年龄、性别、肿瘤位置)的关系.结果CRC患者粪便DNA中SFRP1及SEPT9基因甲基化检出率分别为45.71％(16/35)和51.43％(18/35),均显著高于对照组的8.57％(3/35)和14.29％(5/35),差异均有统计学意义(P<0.01);联合双基因检测结果显示,82.86％(29/35)的CRC患者粪便DNA中至少存在一个基因的甲基化,显著高于单基因检出率(P<0.01),亦高于对照组的17.14％(6/35),差异有统计学意义(P<0.01).CRC患者SFRP1或SEPT9基因甲基化与年龄、性别、肿瘤位置均无关(P>0.05).结论粪便DNA中联合SFRP1及SEPT9基因甲基化检测比单基因检测更加敏感,对老年性CRC早期诊断具有重要的应用价值.
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应用PCR和单克隆抗体方法从人粪便及肿瘤组织中检测大肠癌基因突变的研究
目的:检测大肠癌病人粪便中脱落细胞与肿瘤组织细胞的DNA,对比两者K-ras基因序列和突变位点的变化,为临床非介入性的、简便的大肠癌诊断提供理论和实验依据.方法:分离和提纯大肠癌组织及粪便中脱落细胞的DNA,用PCR(Polymerase chain reaction)法扩增K-ras基因, 克隆K-ras基因PCR产物并进行DNA序列的测定.免疫组化检测大肠癌相应抗原的表达:采用ELISA法,用大肠癌单克隆抗体对大便样品进行检测.结果:同一病人的大肠癌组织细胞与粪便中的脱落细胞的K-ras基因的序列完全一致,并检测到1例K-ras基因点突变.K-ras基因突变与否与大肠癌病理类型和大肠癌单克隆抗体检测大便样品中脱落细胞的癌抗原表达水平有一定的相关性.结论:以大肠癌分子发病机理为基础的非介入性检测粪便中K-ras突变是可行的,有望成为正常人群大肠癌筛查以及诊断的新方法之一,可以为大肠癌的早期发现及监测大肠癌的发生、发展和预后提供理论和实验依据.
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粪便DNA中MGMT、XAF1基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌筛查中的应用研究
目的 使用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测粪便DNA中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)基因启动子甲基化情况,并探讨其在结直肠肿瘤诊断中的意义.方法 收集40例结直肠腺癌、40例腺瘤性息肉、52例正常对照住院患者粪便标本,使用试剂盒提取其粪便中肠道脱离细胞DNA,通过MSP方法检测其MGMT、XAF1基因启动子甲基化情况.结果 MGMT、XAF1基因启动子甲基化在结直肠腺癌中的阳性率分别为50.0％、55.9％;在腺瘤性息肉中的阳性率分别为42.1％、52.6％;二者联合检测在结直肠腺癌及腺瘤性息肉中的阳性率分别为73.5％、68.4％;特异性为52.0％.结直肠腺癌患者粪便中粪便潜血阳性率为35.3％,CEA阳性率为35.3％.结论 通过试剂盒提取粪便DNA具有较高成功率;粪便DNA中MGMT、XAF1基因启动子甲基化状态用于检测结直肠腺癌及腺瘤性息肉具有较高的敏感性.检测粪便基因甲基化有望成为CRC高风险人群筛查的一个重要途径.
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高分辨率溶解曲线分析与基因测序检测粪便DNA对大肠癌筛查作用的比较
目的 用基因测序评价高分辨率溶解曲线分析( high-resolution melting,HRM)检测粪便DNA的可靠性.方法 收集2009年3月～2009年9月在惠州市中心人民医院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1g,应用HRM法和基因测序法检测粪便中apc、k-ras、p53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析.结果 应用HRM在39例大肠癌患者粪便中检出apc基因突变22例,检出率为56.41％ (22/39),经测序HRM阳性的22例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本未发现有基因突变者；检出k-ras基因突变14例,检出率为35.90％ (14/39),经测序HRM阳性的14例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本末发现有基因突变者；检出p53基因突变24例,检出率为61.54％(24/39),经测序HRM阳性的24例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本未发现有基因突变者.结论 HRM法与基因测序的一致率较高,提示HRM法检测粪便DNA突变筛查大肠癌具有潜在的临床应用价值.
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联合检测vimentin和SFRP2甲基化在大肠癌筛查中的应用评价
目的：评价在粪便样本中联合检测vimentin和SFRP2甲基化来筛查大肠癌的性能。方法搜集合格的新鲜粪便标本95例，其中40例大肠癌患者、25例进展期腺瘤患者和30例结肠镜阴性的正常人，应用甲基化特异性PCR（MSP）法检测vimentin和SFRP2甲基化状态，并与单个基因甲基化检测和粪隐血试验（FOBT）的诊断性能相比较是否有统计学差异。结果大肠癌组中vimentin和SFRP2甲基化阳性检出率分别为55.0%（22/40）和70.0%（28/40）；进展期腺瘤组中为48.0%（12/25）和64.0%（16/25）；正常对照组中为6.7%（2/30）和0（0/30）。在病例组中两基因联合检测的敏感性为83.1%（54/65），明显高于vimentin的52.3%（34/65）和SFRP2的67.7%（44/65），更要高于FOBT的27.7%（18/65）（均P<0.05）。而在正常对照组中两基因联合检测的特异性为93.3%（28/30），与vimentin的93.3%（28/30）和SFRP2的100%（30/30）以及FOBT的96.7%（29/30）相比均无明显差异（均P>0.05）。结论在大肠癌筛查中，联合检测粪便中vimentin和SFRP2基因甲基化状态明显优于单个基因和粪便潜血试验，具有潜在的应用价值。(all P<0.05). Conclusions The combination of detecting vimentin and SFRP2 methylation has great perfor-mance for colorectal cancer screening.
关键词： vimentin/SFRP2 粪便DNA 甲基化 MSP 大肠癌 -
检测粪便c-ki-ras2基因点突变筛查大肠癌
目的:研究大肠癌患者粪便c-ki-ras2基因外显子1第12位密码子点突变情况,探讨检测粪便c-ki-ras2基因点突变对筛查大肠癌的价值.方法:提取2005年于广州市第一人民医院就诊的25例大肠癌患者粪便、肿瘤组织和癌旁组织黏膜的DNA,结合限制性内切酶Mva I,用普通聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及突变富集型聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(mutant-enriched PCR-RFLP),分析c-ki-ras2基因外显子1的12位密码子第一、二位碱基是否存在点突变;用同样方法分析正常对照组17例.特异性分析采用经克隆测序已知突变型(12GGT→AGT)及野生型(12GGT)的c-ki-ras2外显子1片段.取同期住院的166例胃肠道疾病患者大便潜血试验(FOBT)检查结果作对照.结果:25例大肠癌患者粪便中,突变富集型PCR-RFLP检出7例k-ras基因点突变(28%),其中6例在相应组织中也检出突变,粪便与组织DNA检测结果高度一致(Kappa=0.896,P＜0.01).正常人粪便未检出突变,两组相比差异有显著性(P＜0.05).癌旁黏膜均未发现突变.普通PCR-RFLP只检出其中3例(12%).c-ki-ras2点突变更多见于左半结肠癌,与结肠其他部位相比差异有显著性(P＜0.05).肠癌患者与其它胃肠道疾病者FOBT阳性率无差异,分别为58%、46%(P＞0.05).结论:粪便c-ki-ras2基因点突变检测特异性达100%,比FOBT(50.6%)高,但单个基因的检测敏感性较FOBT低(28% vs 51.2%,P＜0.05),粪检基因诊断大肠癌有一定应用前景;突变富集型PCR-RFLP较普通PCR-RFLP有更高的检出率.
关键词： 大肠癌 c-ki-ras2基因 粪便DNA PCR/RFLP -
高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便基因突变与临床病理参数的关系
目的 初步探讨高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便DNA突变与临床病理参数的关系.方法 收集2009年3月～2009年9月在本院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1 g,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、P53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析.结果 大肠癌患者粪便中APC、K-ras、P53基因的突变与大肠癌患者性别、年龄、分化状态、病变部位、Dukes分期和有无淋巴结转移无关.结论 未发现粪便APC、K-ras和P53基因突变情况与大肠癌患者的临床病理参数具有相关性.
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粪便DNA检测在结直肠癌筛查中的研究进展
粪便DNA检测筛查结直肠癌(colorectal cancer,CRC)具有非侵人性、患者依从性好、高敏感性和高特异性等优点,目前已从早期的单基因检测发展到多基因联合检测,可能成为CRC筛查和早期诊断的重要辅助手段.本文就粪便DNA检测在结直肠癌筛查中的研究进展作一综述.
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粪便DNA甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的研究进展
粪便基因甲基化作为一种新的、敏感度较高、特异性中等的无创性结直肠肿瘤标志物,能根据其阳性结果对疑似病例进行进一步检测,可作为筛查诊断结直肠肿瘤的一种重要的辅助手段.目前已有较多研究报道检测粪便中基因异常甲基化对于早期结直肠癌(colorectal cancer,CRC)筛查有较高的敏感性和特异性,但尚无任何一种甲基化基因真正地应用于临床实践.本文对目前结直肠癌早期粪便DNA甲基化检测的国内外相关研究成果进行综述,总结粪便甲基化检测的潜在临床价值.
