长期吸烟对大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达和基因突变的影响

目的 观察长期吸烟对Wistar大鼠肺组织p53、K-ras表达的影响,研究吸烟与肺组织p53、K-ras基因突变的关系.方法 建立Wistar大鼠被动吸烟模型.72只雄性Wistar大鼠分为实验组和对照组,实验组被动吸烟6个月,对照组正常呼吸条件下饲养,每个月末分别取6只大鼠肺组织,免疫组织化学观察p53和K-ras蛋白表达情况,聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测p53第5、6、7～8外显子和K-ras第1外显子的突变情况.结果 免疫组织化学结果显示,p53蛋白表达于细胞核,K-ras蛋白表达于胞浆,吸烟组p53、K-ras蛋白表达强度与正常组比较有显著性差异.随着吸烟时间的增加,p53、K-ras蛋白阳性表达率均随吸烟时间的延长而升高.PCR-SSCP显示,p53基因随吸烟时间的延长突变率增加;K-ras基因突变率随吸烟时间延长增加不显著.结论 吸烟可以导致大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达增强和基因突变率增加,随吸烟时间的延长呈上升趋势,为吸烟对肺的组织基因突变的判定及吸烟者肺癌的早期诊断提供理论依据,具有重要的理论和应用价值.

K-ras基因突变两种检测方法的比较

目的 通过比较ARMS实时荧光定量PCR法和DNA直接测序法,分析K-ras基因突变检测结果的一致性,确立临床K-ras基因突变检测的适方法.方法 应用ARMS实时荧光定量PCR法及DNA直接测序法检测34例石蜡标本的K-ras基因第12位和第13位密码子的基因突变,结果比较采用x2检验.结果 这两种方法对K-ras基因第12和第13密码的基因突变检测结果无统计学差异,ARMS实时荧光定量PCR法比测序法操作简便,敏感度更高.结论 相较于DNA直接测序法,ARMS实时荧光定量PCR法更适用于临床检测.

K-ras基因在卵巢交界性肿瘤中的研究与展望

1898年Pfannemstiel描述了卵巢乳头状囊腺瘤,之后卵巢交界性上皮肿瘤争论了近百年.直到上世纪70年代,FIGO将卵巢上皮肿瘤分为良性囊腺瘤、增生的上皮细胞及核异型的囊腺瘤但无浸润性破坏生长(低度恶性潜能)和囊腺癌.

突变K-ras 基因在胰腺导管腺癌起始过程中的作用

西妥昔单抗联合mFOLFOX6一线治疗k-ras野生型结直肠癌肝转移临床疗效观察

目的：评价西妥昔单抗联合mFOLFOX6一线治疗k-ras野生型结直肠癌肝转移患者的临床疗效及安全性。方法本院自2008年1月至2011年12月收治的失去手术机会的晚期结直肠癌肝转移患者39例，其中一线接受西妥昔单抗联合mFOLFOX6方案治疗19例（联合组），单用mFOLFOX6方案化疗20例（化疗组），具体方案为：西妥昔单抗首次400 mg/m2，静脉滴注120 min，后续每周250 mg/m2，静脉滴注60 min，每周给药1次或500 mg/m2，首次静脉滴注120 min，之后每次滴注60 min，每2周给药1次；mFOLFOX6方案：奥沙利铂85 mg/m2，第1天，LV 400 mg/m2，第1天，5-FU 400 mg/m2，静推，第1天，2400 mg/m2，持续静注46 h，2周为一周期；化疗组仅接受上述mFOLFOX6方案化疗。结果全组39例患者均可评价疗效，联合组获得CR 2例（10.5%），PR 11例（57.9%），SD 4例（21.1%），PD 2例（10.5%）， RR为68.4%，DCR为89.5%。化疗组获得CR为0例，PR 6例（30.0%），SD 8例（40.0%），PD 6例（30.0%）， RR为30.0%，DCR为70.0%。两组缓解率RR比较有统计学差异（P＝0.016），中位PFS分别为10.4个月、6.3个月，联合组优于化疗组；获得R0肝转移灶切除者两组分别为36.8% vs.10.0%（P＝0.047），手术者PFS分别为12.6个月、15.6个月，均优于未获得手术机会的患者；主要不良反应为皮疹、腹泻、恶心呕吐、神经毒性及血液学毒性，均可耐受。结论西妥昔单抗联合mFOLFOX6一线治疗k-ras野生型晚期结直肠癌肝转移患者，获得较好的临床缓解率及更高的肝切除率，获得R0肝转移灶切除的患者可以获得更高的疾病无进展时间，两组不良反应均可耐受，值得在临床推广应用。

大肠癌与抑癌基因相关性的研究现状

大肠癌是常见的高危害消化系恶性肿瘤,全球每年新发病例约为120万例.近年来,随着人们生活水平的提高,饮食习惯和结构的改变,我国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速,而且,发病年龄明显提前,目前,我国大肠癌中位发病年龄为58岁,比欧美等国家提前12-18年.大肠癌的发生是一个多阶段多步骤的、涉及多个基因改变的复杂过程.许多研究表明,结直肠癌变是一个涉及原癌基因激活、抑癌基因失活等多基因、多阶段、多步骤渐进演化的积累过程.与结直肠癌相关的抑癌基因有P53、APC、DCC、MMR等,原癌基因k-ras、c-myc等.本文就以上基因改变与大肠癌的发生发展相关性的研究现状作一简单复习.

k-ras基因在中国结直肠癌患者中的突变状态

目的:评价中国结直肠癌患者中K-ras基因突变状态及其与临床病理参数的关系.方法:收集2008-01/2009-12在中国人民解放军南京军区福州总医院手术切除的临床资料完整的结直肠癌石蜡包埋组织280例,分别应用实时荧光定量PCR和直接测序法检测结直肠癌中K-ras基因外显子2中第12、13编码子上常见的7种突变类型,即第12编码子的35G>A、35G>T、35G>C、34G>A、34G>T、34G>C及第13编码子的38G>A,同时将两种检测结果进行比对分析.结果:(1)经直接基因测序,确认在280例结直肠癌中,K-ras基因测序阳性(基因突变型)94例,阳性率33.57%(94/280),其中第12编码子的35G>A、35G>T、35G>C、34G>A、34G>T及34G>C的突变率分别为14.64%(41/280)、4.29%(12/280)、0.36%(1/280)、2.86%(8/280)、3.57%(10/280)、0.36%(1/280),第13编码子的38G>A的突变率为7.5%(21/280);(2)94例K-ras基因测序阳性(基因突变型)病例中,实时荧光定量PCR阳性91例[灵敏度96.8%(91/94)],阴性3例;186例基因测序阴性(野生型)中,实时荧光定量PCR阴性184例[特异性98.9%(1 84/186)],阳性2例;实时荧光定量PCR法与直接基因测序法符合率为98.2%[(91+184)/280];(3)K-ras基因突变与患者性别、年龄相关(均P<0.05),而与肿瘤部位、分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移无相关性(均P>0.05).结论:(1)中国结直肠癌患者中存在较大比例的K-ras基因突变(33.57%),在临床选取表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂和抗EGFR单抗靶向药物治疗结直肠癌患者之前均应常规检测K-ras基因突变状态,从而为靶向治疗提供可靠的参考依据;(2)实时荧光定量PCR检测结果与基因测序检测结果高度一致,实时荧光定量PCR能够准确、快速、简便的检测出结直肠癌K-ras基因突变位点,可用于结直肠癌K-ras基因突变的检测;(3)K-ras基因突变与结直肠癌的生物学行为无明显相关性,但在≥60岁的女性人群中K-ras基因突变率较高.

胰腺癌及相关胰腺疾病组织中K-ras12、13密码子突变的检测及其临床诊断价值

目的 研究K-ms基因第12、13位密码子突变在胰腺导管腺癌及相关胰腺疾病组织中的定量检测及其临床意义.方法 收集经手术切除的130例(胰腺导管腺癌105例,胰腺腺鳞癌8例,胰腺黏液腺癌2例,内分泌癌3例,十二指肠及壶腹部恶性肿瘤6例,胰腺良性疾病6例)有明确病理诊断的组织标本及临床资料,应用双荧光探针联合肽核酸钳制实时定量PCR方法检测组织中K-ras基因第12、13密码子的突变量,以突变量＞100拷贝为阳性计算突变阳性率.结果 胰腺导管腺癌、腺鳞癌、黏液腺癌、内分泌癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密码子突变量的中位数及四分位数分别为4062(495,10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56)；突变阳性率分别为84.8％ (89/105)、50.0％(4/8)、0、0、66.7％ (4/6)和16.7％(1/6).胰腺导管腺癌的K-ras12密码子突变量及阳性率与胰腺腺鳞癌、十二指肠及壶腹部恶性肿瘤差异无统计学意义,而较胰腺黏液腺癌、内分泌癌、胰腺良性疾病显著增加(P值均＜0.05).通过接受者操作特征(ROC)曲线分析,胰腺导管腺癌K-ras 12密码子突变的曲线下面积为0.727,诊断胰腺导管腺癌的敏感性及特异性分别为84.8％、64.0％.胰腺导管腺癌的K-ras基因第12密码子突变量与患者生存期显著相关.胰腺导管腺癌的K-ras 13密码子突变量及阳性率与其他胰腺疾病的差异无统计学意义.结论 K-ras12密码子基因突变对胰腺癌有较好的鉴别诊断及患者预后判断价值.

外周血K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的应用

目的 检测胰腺癌患者外周血K-rag基因第12、13密码子突变,探讨其对胰腺癌的诊断价值.方法 选取经病理证实的胰腺癌患者54例以及健康志愿者33例.抽取全部实验者外周血标本,抽提循环中的DNA,应用肽核酸钳制实时定量PCR法检测K-rag基因突变,并分析其与患者临床病理参数的相关性.结果 54名胰腺癌患者中,40例(74.1%)外周血标本可检测出K-ras基因第12或13密码子突变.33名健康志愿者外周血标本无一例检出K-ras基因突变.外周血中K-ras基因的突变与患者年龄、淋巴血管侵犯、肿瘤分化程度、肿瘤临床分期、CA19-9水平有关(P＜0.05),而与患者性别、肿瘤部位、肿瘤大小及病理类型无关.结论 肽核酸钳制实时定量PCR法检测外周血K-ras基因突变的敏感性高.外周血K-ras基因突变的检出提示肿瘤具有高侵袭性,可能预后不良.

肽核酸钳制-PCR检测K-ras突变法的阳性判断阈值及检测下限的研究

目的 确定肽核酸钳制-PCR(PNA-PCR)检测K-ras突变的阳性判断阈值(Cut off)和检测下限.方法 将含K-ras基因12或13密码子突变的胰腺癌细胞株PANC1、SW1990基因组DNA以不同的浓度分别与K-ras野生型的胎盘DNA混合配制成含不同突变率(0、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.1％、6.25％、12.5％、25％、50％)的样本,并制备1％突变率PANC1细胞及30％突变率SW1990细胞DNA总量分别为50、20、5、1 ng和50、10、5、1 ng的样本.应用PNA-PCR方法检测样本中的K-ras基因12、13密码子突变,收集它们的突变Ct值、总体Ct值,并计算出△Ct值(突变Ct值-总体Ct值).实验重复10次.采用受试者工作特征(ROC)曲线分析△Ct值,确定K-ras基因突变的适Cutoff值,计算诊断阳性率及确定诊断下限.结果 所有不同突变率的PANC1细胞12密码子突变以及SW1990细胞13密码子突变的突变Ct值及△Ct值与阴性对照样本的差异均有统计学意义(P值均＜0.05),而总体Ct值与阴性对照样本的差异无统计学意义.诊断K-ras基因12密码子突变的ROC曲线下面积(AUC)为0.926,适Cut off值为11,相应的敏感度和特异度为84％和100％,检出下限为0.4 ng;诊断K-ras基因13密码子突变的AUC为0.906,适Cut off值为9.5,相应的敏感度和特异度为71％和100％,检测下限为1.5ng.固定突变率的检测结果进一步确定上述的检测下限.结论 成功确立了PNA-PCR法检测K-ras基因12、13密码子突变的Cut off值和检测下限,达到临床应用的要求.

K-ras基因第12密码子突变在胰腺癌早期筛检与鉴别诊断中的潜在临床意义(文献综述)

总结近10余年来胰腺癌K-ras基因第12密码子突变研究的进展及其在胰腺癌筛检和与慢性胰腺炎鉴别诊断潜在的临床价值.

胰液中K-ras基因突变和p16基因甲基化改变联合检测在胰腺癌诊断中的初步研究

目的 探讨胰液中K-ras基因突变和p16基因启动子区5′CpG岛甲基化联合检测在胰腺癌诊断中的价值.方法 采用ERCP下放置鼻胰管收集胰液,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法检测胰液中K-ras基因12密码子点突变,PCR-MSP法检测胰液中p16基因甲基化状态.结果 所有胰液标本均成功抽提出DNA,30例胰腺疾病病人胰液标本同时进行了K-ras基因突变和p16基因启动子区5′CpG岛甲基化检测,其中20例胰腺癌病人胰液中K-ras基因突变率为70%(14/20),p16基因甲基化率为35%(7/20),8例慢性胰腺炎中K-ras基因突变率为25%(2/8),2例胰腺囊腺瘤病人中K-ras基因突变率为50%(1/2),慢性胰腺炎和胰腺囊腺瘤病人胰液中无p16基因甲基化.单纯胰液中K-ras基因突变检测诊断胰腺癌的敏感性为70%(14/20),特异性为70%(7/10),阳性预测值为82.4%(14/17),阴性预测值为53.8%(7/13),诊断准确性70%(21/30).胰液中p16基因甲基化与K-ras基因联合诊断胰腺癌的敏感性为70%(14/20),特异性为100%(10/10),阳性预测值为100%(14/14),阴性预测值为62.5%(10/16),诊断准确性80.0%(24/30).结论 鼻胰管收集的胰液可用于分子生物学检测,联合检测胰液中K-ras基因突变和p16基因启动子区5′CpG岛甲基化更有助于胰腺癌的诊断.

靶向突变K-ras基因的小干扰RNA体内外抑制肺癌细胞生长的研究

目的 探讨应用小干扰RNA(siRNA)敲除突变K-ras基因对肺癌细胞H441体内外生长的抑制作用.方法 构建真核表达载体pSilencer3.1-K-rasV12,转染H441细胞后应用半定量RT-PCR及Western blotting检测突变K-ras基因mRNA及蛋白质的表达变化,噻唑蓝法检测H441细胞增殖速度的变化,流式细胞仪检测H441细胞凋亡率的变化.裸鼠皮下移植pSilencer3.1-K-rasV12处理的H441细胞,观察其成瘤性的改变.结果 测序证实pSilencer3.1-K-rasV12真核表达载体构建成功.RT-PCR灰度比值结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-ras mRNA相对表达量分别为:93.7%±2.2%、95.1%±2.5%、43.6%±3.1%,差异有统计学意义(F=78,P＜0.01);Western blotting结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-ras蛋白相对表达量分别为:98.1%±2.4%、97.5%±2.0%、33.5%±3.7%,差异有统计学意义(F=93,P＜0.01);经pSilencer3.1-K-rasV12作用的H441细胞生长受到明显抑制(P＜0.05),凋亡率较对照组明显升高(F=8.9,P＜0.01),H441细胞在裸鼠体内生长受到明显抑制.结论 靶向突变K-ras基因的siRNA可以抑制肺癌H441细胞在体内外的生长速度,诱导细胞凋亡,为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法.

针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2作用的研究

目的探讨针对于胰腺癌K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2的作用.方法用脂质体将针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC-2(反义组),转染正义寡脱氧核苷酸(正义组)和生理盐水(对照组),免疫组化和原位杂交检测靶基因表达,人工计数、噻唑蓝(MTT)和集落形成实验检测细胞增殖情况.结果转染48 h后,反义组ras蛋白和K-ras基因mRNA的表达强度较正义组和对照组均明显降低(P<0.05).人工计数、MTT检测和集落实验均证实反义组细胞增殖受到明显抑制(P<0.05).结论针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的胰腺癌细胞,对靶基因表达和细胞增殖有明显的抑制作用.

直肠癌术前放疗前后K-ras基因突变的研究

目的检测直肠癌术前放疗前后原癌基因Kirsten大鼠肉瘤病毒转化基因(K-ras基因)突变率的变化,从细胞遗传学方面深入研究放射治疗对直肠癌的作用.方法 pTNM Ⅱ期和Ⅲ期直肠癌病人40例.病人术前行40 Gy放疗,放疗前和术中分别取癌组织、距边缘2、4和6 cm正常黏膜采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法检测K-ras基因第12密码子突变.结果癌组织中K-ras基因突变率显著高于癌周正常黏膜,同时距癌边缘2 cm黏膜的K-ras基因突变率显著高于距癌边缘4、6 cm黏膜的.放疗后癌组织和距癌边缘2 cm黏膜的K-ras基因突变率与放疗前相比显著降低.结论距肿瘤2 cm之内的黏膜有较高的K-ras基因突变率,向恶性转化的可能较大,放疗后癌组织和癌旁黏膜K-ras基因突变率显著降低,因此,放疗可能抑制癌旁黏膜恶变的早期事件,这可能是放疗能增加手术切除率和保肛率的原因.

西妥昔单抗治疗晚期结肠癌1例报告及文献复习

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤.确诊为结直肠癌的患者中有50％～60％会发生转移.晚期结直肠癌以全身治疗为主,20世纪90年代后期开始应用奥沙利铂、伊立替康等药物后,晚期结直肠癌的治疗有效率及生存期均显著改善.Ⅳ期结肠癌或复发的患者可以同时发生肝转移或肺转移.单纯肝转移或肺转移患者仍有治愈可能.15％ ～ 25％的结直肠癌患者同时伴有肝转移,其中80％ ～ 90％的患者初次评估时肝转移灶无法手术切除[1].通过积极的转化治疗,部分患者可获得手术机会.随着贝伐单抗、西妥昔单抗等靶向治疗药物的出现,晚期结直肠癌的治疗又上了一个新台阶.西妥昔单抗是重组人鼠嵌合的单克隆抗体,能与细胞外表皮生长因子受体特异性结合,从而阻断受体细胞内区域的酪氨酸激酶磷酸化,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡.

结直肠癌原发灶、相应肝转移灶K-ras基因状态的研究

目的 观察结直肠癌患者原发肿瘤组织及相应肝转移灶K-ras基因突变情况,分析二者的一致性.探讨结直肠癌K-ras基因状态与肝转移关系.方法 实时荧光定量PCR技术和基因测序技术检测76例结直肠癌患者原发肿瘤组织及其中22例肝转移灶K-ras基因突变,结合其临床资料分析.结果 76例结直肠癌组织中25例(32.9%)发现K-ras基因突变;22例肝转移灶中11例(50%)发现K.ras基因突变,其中10例对应原发癌组织也发现K-ras基因突变.1例对应原发癌组织未发现突变.原发癌组织与肝转移灶K-ras基因状态一致率为90.9%.肝转移患者原发癌组织K-ras基因突变率明显高于无肝转移患者(P<0.05).原发肿瘤组织和7例同时性、2例异时性肝转移灶的K-ras基因突变类型基本一致(即K-ras基因12密码子GGT突变为GAT或GTr).1例异时性和1例同时性肝转移灶K-ras基因突变类型为13密码子GGC突变为GAC.结论 结直肠癌的原发癌组织与肝转移灶的K-ras基因状态较为一致,原发癌组织有K-ras基因的突变,预示着肿瘤有肝脏转移倾向.

改进MSP法对肿瘤患者血清DNA的探测

目的寻找一种切实可行的检测方法及肿瘤的生物标志物.方法用改良的Herman 新方法对111例不同癌症患者的血清及部分组织进行了p16异常甲基化检测,同时对55例患者检测突变K-ras基因作为比较.结果各期住院患者血清及癌组织p16异常甲基化均在50%左右,与正常人及非恶性肿瘤对照组比较差异有显著性(P<0.05).早期癌血清与组织无明显差异.晚期癌症患者阳性率明显上升(P<0.05);术后20 d基本消失.突变K-ras基因的阳性率仅为30%,较前者明显为低,如二者联合应用可提高阳性率13%.结论改进MSP法检测血清中异常甲基化是一种行之有效的方法,与突变K-ras基因检测联合应用,则效果更好.

K-ras基因突变与胰腺癌的早期诊断

胰腺癌具有起病隐匿、诊断困难、进展快和预后差等特点,其发病率在我国近20年增长了4倍.早期胰腺癌手术切除率在90％以上,5年生存率可达37％,晚期胰腺癌的5年生存率低于5％[1],所以加强对胰腺癌的预防和高危人群的监测,及时发现早期病例,是提高胰腺癌诊治效果的关键.

K-ras基因型与转移性结直肠癌患者的疗效及预后的关系

目的 分析转移性结直肠癌患者的K-ras基因型与临床疗效和患者预后的关系.方法 回顾性分析153例不同K-ras基因型的转移性结直肠癌患者的临床特征、治疗方案和生存情况.结果 K-ras野生型患者的中位总生存时间(OS)为31.7个月,高于突变型患者(21.3个月,P=0.037).K-ras野生型患者中,抗表皮生长因子受体(EGFR)单抗联合化疗组的有效率高于单纯化疗组(P＜0.05)；抗EGFR单抗联合化疗组的无进展生存时间(PFS,9.6个月)高于单纯化疗组(6.6个月,P=0.036).接受抗EGFR单抗联合伊立替康为主的二线化疗的患者的有效率和PFS均高于单纯化疗组(P=0.003和P=0.019).抗EGFR单抗联合化疗序贯治疗组患者的中位PFS为11.5个月,高于同时治疗组(5.2个月,P=0.02)；序贯治疗组患者的中位OS为39.3个月,高于同时治疗组(31.7个月,P=0.034).结论 在转移性结直肠癌中,K-ras基因野生型患者的预后可能优于突变型.采用抗EGFR单抗联合化疗的序贯模式治疗,可以明显改善K-ras野生型患者的生存状况.