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K-ras基因突变两种检测方法的比较
目的 通过比较ARMS实时荧光定量PCR法和DNA直接测序法,分析K-ras基因突变检测结果的一致性,确立临床K-ras基因突变检测的适方法.方法 应用ARMS实时荧光定量PCR法及DNA直接测序法检测34例石蜡标本的K-ras基因第12位和第13位密码子的基因突变,结果比较采用x2检验.结果 这两种方法对K-ras基因第12和第13密码的基因突变检测结果无统计学差异,ARMS实时荧光定量PCR法比测序法操作简便,敏感度更高.结论 相较于DNA直接测序法,ARMS实时荧光定量PCR法更适用于临床检测.
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以测序法为准比较HRM法、ADx-ARMS法和TaqMan探针法检测肺腺癌EGFR基因突变的敏感性
目的 采用高分辨率熔解曲线法(HRM法)、Adx-ARMS法、TaqMan探针法和直接测序法检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因(EGFR)的突变情况,并比较各方法的检测效率和敏感性.方法 收集20例肺腺癌石蜡包埋肿瘤组织,其中18例为手术切除标本,2例为穿刺小标本,应用HRM法、ARMS法和TaqMan探针法分别检测EGFR基因突变,对检测结果不一致的样本采用测序法加以验证.结果 20例肺腺癌组织样本中,HRM法、ARMS法和TaqMan法分别在13例、10例和8例组织中检测到EGFR基因突变,差异不显著(P＞0.05).差异标本经测序验证后发现,HRM法可检测未知突变,而ARMS法和TaqMan探针法只能检测已知突变.对于2例穿刺小标本,HRM法和ARMS法均检测到突变,而TaqMan探针法未检测出突变,HRM法和ARMs法的检测敏感性高于TaqMan探针法.结论 HRM法、ARMS法、TaqMan探针法和测序法各有优缺点,HRM法敏感性高,且能检测到少见突变与未知突变,因此HRM法结合测序法能更全面的检测出各种突变类型.
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制作胸水细胞蜡块检测肺腺癌EGFR突变
近年来,我国肺癌发病率和病死率呈显著上升趋势,60％ ～ 85％肺癌患者发现时已属晚期,无法进行根治性手术切除.表皮生长因子受体(EGFR)基因突变状态已成为晚期肺腺癌指导治疗和判断预后的重要指标,但目前突变特异性扩增系统(ARMS)技术检测肺癌实体瘤EGFR基因突变情况,大部分是在手术活检标本上应用,传统的细胞学制片技术普遍存在不易于观察、阳性检出率低、样本无法长期保存等诸多缺点.本文采用肺腺癌胸水肿瘤细胞制成细胞蜡块,进行免疫组化检测和ARMS技术检测肺腺癌瘤细胞EGFR突变情况,探讨肺腺癌晚期患者胸水利用价值,对临床洽疗筛选靶向药物提供分子病理学依据.
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横纹肌肉瘤比较基因组杂交研究现状
横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RMS)是儿童软组织肿瘤中常见的一种恶性肿瘤,可能是骨骼肌形成过程中异常增殖和分化的结果.根据组织学和遗传学特征RMS可分为3种亚型;较常见的胚胎性横纹肌肉瘤(embryonal rhabdomyosarcoma,ERMS)、更具侵袭性的腺泡状横纹肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma,ARMS)和罕见的成人多形性横纹肌肉瘤(pleomorphic rhabdomyosarcoma,PRMS)[1-2].
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猪基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子检测
本文建立了一种简便、准确的鉴别猪基源的肝素粗品及其混淆品的DNA分子鉴定方法.在对家猪、野猪及其他7种动物(均用于加工猪肝素粗品的混淆品)的mtDNA D-loop区进行序列分析的基础上,设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物,对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测.结果表明:AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别.AS-PCR鉴别时的复性温度为54～56℃,ARMS引物鉴别时的复性温度更宽,为52～58℃.在用两种引物对肝素样品进行鉴别时,仅猪来源的肝素DNA模板能扩增得到约170 bp的扩增条带,而其他动物来源的肝素DNA模板在同样条件下无扩增产物.
关键词： 猪基源肝素钠 mtDNA D-loop区 AS-PCR ARMS 分子鉴别 -
药房实用英语对话
过敏(Allergy)Pharmacist: Hello! Mav I help you?药师:您好,您需要些什么?Client: I found a lot of spots all over my arms when I got up this morning, and my skin feels very itchy. I thought it could be due to too much seafood I ate yesterday.
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ARMS法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变及临床意义
目的:探讨应用突变特异性扩增系统法(ARMS)检测非小细胞肺癌(NSQC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的特点.方法:收集220例浙江南部地区NSCLC患者肿瘤样本,分别采用ARMS法和测序法检测EGFR基因18、19、20、21号外显子突变情况,并分析EGFR突变与病理类型、突变种类、患者年龄和性别的关系.结果:两方法比较,相符率为86.81％(158/182,Kappa=0.732,P＜0.01).总突变率为47.27％(104/220),其中腺癌的突变率明显高于鳞癌(52.46％ vs 17.14％;P＜0.01).肺腺癌中,女性患者EGFR突变率明显高于男性(65.56％ vs 39.78％;P＜0.01).突变样本中,21外显子错义突变(L858R)所占比例高(62.5％,65/104),19外显子缺失(19Del)其次(43.27％,45/104),其中两者同时突变占5.77％(6/104);但腺癌女性与男性患者L858R突变率(64.41％ vs 56.76％)不存在显著性差别.结论:采用ARMS法检测EGFR基因突变较测序法敏感,突变主要发生在女性肺腺癌患者,以L858R突变为主.
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对仰卧位手术病人用中单固定两臂的弊端的护理对策
仰卧位是常见的手术体位,它适用于腹部、颌面部、颈部、骨盆及下肢手术等.在临床工作中,我们对300例仰卧位用中单固定两臂于体侧,且掌面向下的手术病人,进行术中观察发现一些弊端:①静脉点滴不畅36例,占12%;
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几种常规实验室适用的单核苷酸多态性检测方法原理与应用
该文讨论了适用于常规实验室的一些单核苷酸多态性(SNP)检测方法,比较了不同方法在SNP检测中的优缺点,并介绍了一些新的方法.
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扩增阻滞突变系统法检测非小细胞肺癌微小标本表皮生长因子受体突变
目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)微小标本代替大体标本用于扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)法检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变的可行性.方法:181例NSCLC标本纳入本研究,包括157例微小标本(分别为CT引导下经皮肺穿刺活检标本、支气管内超声引导下针吸活检标本、淋巴结活检标本、支气管镜活检标本和胸腔积液)和24例大体标本.采用QIAGEN DNA提取试剂盒提取标本组织DNA,然后使用AmoyDx人类EGFR基因4种突变荧光PCR检测试剂盒检测EGFR基因的突变情况,后采用x2检验或Fisher精确检验比较微小标本与大体标本的EGFR突变检出率.结果:181例标本中,EGFR的总突变率为39.8％ (72/181);其中微小标本的EGFR突变检出率为38.9％,大体标本的EGFR突变检出率为45.8％,2者间差异无统计学意义(P=0.515).EGFR突变率在不吸烟患者(P=0.033)和腺癌患者(P＜0.001)中显著增高.结论:ARMS法检测NSCLC微小标本也能获得较高的EGFR突变检出率.对于晚期难以获得大体标本的NSCLC患者,微小标本可代替大体标本应用于临床EGFR突变检测.
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细胞蜡块在晚期腺癌诊断和肺腺癌个体化治疗中的应用价值
目的 探讨细胞蜡块在晚期腺癌诊断及肺腺癌个体化治疗中的应用价值.方法 收集细胞学制片后剩余的细胞标本制备蜡块,行HE染色;同时选择TTF1、Napsin A、CK7、CK20、Villin、CDX2等抗体,对来源不明的肿瘤细胞进行免疫组化标记,并对明确诊断肺腺癌的病例,采用ARMS法检测EGFR基因突变.结果 72例患者中,64例有恶性细胞,8例有异型腺样细胞.64例恶性细胞中腺癌50例,鳞状细胞癌4例,小细胞癌8例,膀胱癌1例,白血病1例.不同组织类型的肿瘤细胞在石蜡切片中具有特征性表现,腺癌细胞呈腺样、乳头状或单个散在排列;鳞状细胞癌呈典型组织学表现,可见细胞间桥;小细胞癌的形态与细胞涂片相似.50例腺癌的免疫组化结果及临床证实为肺腺癌29例,胃腺癌4例,大肠癌3例,卵巢腺癌5例,乳腺癌2例,胆囊癌1例,睾丸卵黄囊瘤转移1例;1例临床提示肺占位,但免疫组化标记不表达任何抗体;4例起源不明.8例异型腺样细胞的免疫组化标记显示异型细胞为增生的间皮细胞.29例肺腺癌中,22例采用ARMS法进行EGFR基因检测,结果显示EXON-19 E746_A750del(1)(2)突变和EXON-21 L858R突变各5例,突变阳性率为45.4％ (10/22).结论 利用细胞学剩余标本制备蜡块,结合免疫组化标记和分子病理技术有助于晚期肿瘤的诊断,并为个体化治疗方案的选择提供帮助.
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ARMS法检测非小细胞肺癌EGFR基因位点不同的比较性分析
目的 分析扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测EGFR基因不同位点数的突变检出率差异.方法 回顾性分析 ARMS法对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)石蜡包埋组织标本EGFR基因4位点突变及29位点突变检测情况.结果 ARMS法检测NSCLC EGFR基因 (19、20、21号外显子)4位点突变的突变率为29.14％,EGFR基因(18、19、20、21号外显子)29位点突变率为44.60％. NSCLC中EGFR基因突变率在4位点与29位点差异具有显著性(P＜0.001) ; EGFR基因4位点在NSCLC腺癌中的突变率为32.23％,而29位点的突变率为46.88％,两者突变率差异有显著性(P＜0.001);但19Del与L858R点突变各自在两种不同位点试剂检测中NSCLC突变率及腺癌突变率差异无统计学意义(P＞0.05).EGFR 29位点试剂检测中女性患者与男性患者的突变率差异有统计学意义(P＜0.001),但4位点试剂检测差异无统计学意义(P＞0.05);男性患者检测EGFR基因29位点的突变率高于4位点突变率,但差异无统计学意义(P＞0.05),女性患者表现出更高的突变率,且29位点与4位点突变率差异有显著性(P＜0.001).结论 艾德公司设计EGFR基因29种检测位点在 NSCLC或腺癌或女性患者中的突变率明显高于EGFR基因4位点突变率;同时,通过了解这两种不同位点检测试剂所体现出不同突变检出率,还有助于不同情况下不同人群EGFR靶点检测选择提供了数据支持,具有较高的临床意义.
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应用ARMS检测不同类型的肺腺癌标本EGFR基因突变
目的：探讨应用扩增阻滞突变系统（ amp1ification re-fractory mutation system，ARMS）法检测不同类型肺腺癌标本表皮生长因子受体（ epithe1ia1 growth factor receptor，EGFR）基因突变的特点。方法收集80例山东省西部地区肺腺癌患者肿瘤标本（胸水细胞块、肺活检、手术切除组织），采用ARMS法检测EGFR基因19、20、21号外显子突变状态，并分析EGFR突变与标本类型、患者性别、年龄、吸烟状态及家族史等的关系。结果肺腺癌中，总EGFR突变率为41.25%，胸水细胞块、肺活检、手术切除组织 EGFR 突变率分别为43.14%、31.25%、46.15%（ P =0.649）。EGFR 突变标本中，21号外显子错义突变（L858R）发生比例高（59.58%，19/33），其次为19号外显子缺失（19de1）（39.39%，13/33），二者同时突变占3.03%（1/33）；女性与男性的突变率差异有显著性（54.55% vs 25.00%，P=0.008）；吸烟与不吸烟患者的突变率差异有显著性（25.81% vs 51.02%，P=0.026）。结论在肺腺癌中，胸水细胞块、肺活检、手术切除组织等标本均可用于EGFR基因突变检测，21号外显子L858R突变常见；女性、不吸烟患者突变率明显高于男性、吸烟患者。
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ARMS法检测同一位点连续突变的病理解决方案
扩增受阻突变体系( amplification refractory mutation sys-tem, ARMS)法是分子病理检测领域发展快的方法之一,其是建立在RT-PCR基础上的检测方法,灵敏度高。 ARMS法作为RT-PCR检测方法的发展和延伸,也具有RT-PCR法的缺点,即污染对检测结果的影响。在我科日常的分子病理检测中,曾出现一起连续检测到多例同一位点发生突变的事件,在本科科主任的带领下,与临床医师、受检患者、医院主管领导、试剂生产与供货方沟通后,妥善解决一起可疑污染事件,形成一套较为完备的分子病理预警处理方案,现报道如下。
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ARMS与NGS对比检测NSCLC患者标本EGFR、KRAS、BRAF、EML4-ALK融合等基因探索
目的 探讨突变扩增阻滞系统(ARMS)法和下一代测序(NGS)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者标本多驱动基因改变上的差异,指导临床个体化治疗.方法 51例NSCLC患者标本首先采用ARMS法,对所有样本进行表皮生长因子受体(EGFR)、鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1 (BRAF)、棘皮动物微管相关类蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)等基因检测,随后采用NGS对上述标本进行高通量检测对比,收集临床资料,定期随访.结果 51例NSCLC样本应用ARMS法与NGS检测EGFR、KRAS、EML4-ALK突变阳性率(48.9％vs53.3％、11.1％ vs 8.9％、13.7％ vs 5.9％)差异无统计学意义.两种方法检测出的EGFR-19del突变组比EGFR-L858R突变组靶向治疗生存期较长,差异有统计学意义(P=0.0L0),但两组在性别、年龄、靶向治疗阶段等方面差异无统计学意义.NGS法检测出EGFR-19del、L858R突变患者肿瘤特有基因平均数量分别为7.1、4.6个,EGFR-L858R多为抑癌基因突变(91％).2例EGFR/KRAS双突变患者较EG-FR单突变患者预后差.结论 ARMS法和NGS均适用于NSCLC患者突变驱动基因检测.对于DNA点突变检测,NGS不仅显示ARMS检测的遗漏,还显示突变丰度、伴随突变及非常规突变等,对ARMS检测有补充作用.EGFR-19del患者靶向治疗生存期比EGFR-L858R突变患者长,EGFR-L858R主要为抑癌基因突变.EGFR合并KRAS双突变患者预后较差,但仍需进一步研究证实.
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运用ARMS法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变
目的探讨应用突变特异性扩增系统法(ARMS)检测非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变.方法收集20例芜湖中医院2014年1月至12月NSCLC患者肿瘤样本,采用ARMS法检测EGFR基因18、19、20、21号外显子突变情况.结果在20例NSCLC患者中,18例ARMS法检测成功;ARMS法检测本群患者EGFR突变率为44.4％(8/18).在所有突变类型中,19外显子缺失突变3例,20外显子1例插入突变(S768I),20号外显子T790M错义突变2例,21号外显子错义突变(L858R)3例,其中1例同时出现20号外显子T790M突变及21号外显子(L858R)突变.结论ARMS法检测EGFR基因突变敏感,整个实验过程小于3h,操作简单,能够满足临床快速检测的要求,易于普及,而且ARMS可以检测到1％含量的突变DNA,敏感性高.特别是对于小标本及肿瘤组织含量少的标本有明显的优势.
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PCR的优化与发展
实时荧光定量PCR亦成为RT-QPCR的出现,确定了PCR(聚合酶链)反应的技术实现由了定性检测到兼定量检测靶标核苷酸序列的华丽变身,是对PCR质变式的优化,但是该技术在现实应用中依然存在着大量的难以克服的障碍:分析溶解曲线的过程耗时很长、标记任意荧光探针的费用昂贵、非特异性的扩增干扰等,长时间来都阻碍着RT-QPCR的技术应用.迄今,PCR中隐含的这些难题的具体机理仍未被彻底弄明白,所以无法从彻底被消除,因此多种优化PCR的技巧需要被采纳以推动应用方面和在其有关的领域的研究发展.因此,PCR技术中有关优化方案的研究发展迅速,这不仅仅能够提高PCR方法的扩增效率,还能有针对性地抑制非特异性扩增,PCR定量分析、检测技术的适用范围被无限推广,而且对于分子生物学的核心技术的发展而言也有利于其顺利地发展.本文就目前对PCR优化与发展的近期进展进行了论述和展望.
