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非小细胞肺癌与结直肠癌KRAS突变分析
肺癌和结直肠癌都是很常见、发病率很高的恶性肿瘤.肺癌目前是全世界癌症死因的第1名,其中80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1].结直肠癌是癌症死亡的第3大原因,每年几乎有100万例的发病率,无论在男性还是女性[2].由于很多患者在诊断时已经处于中晚期,常规治疗往往不能达到预期效果.随着分子靶向药物的研发和个体化治疗的发展,使得癌症患者的治疗有了很大改善,如酪氨酸激酶抑制剂的应用.KRAS基因与肺癌和结直肠癌的发生发展有着密切的关系,同时KRAS突变是所有肿瘤中突变频率高的基因,因此成为研究的焦点.KRAS基因是EGFR的下游因子,若基因发生突变,则患者不能从酪氨酸激酶抑制剂中获益.因此KRAS的突变成为靶向治疗的关键.本研究用测序法检测非小细胞肺癌和结直肠癌中KRAS的突变情况,研究其与临床病理特征之间的关系,并横向比较KRAS基因突变在两种癌症间的异同.
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以测序法为准比较HRM法、ADx-ARMS法和TaqMan探针法检测肺腺癌EGFR基因突变的敏感性
目的 采用高分辨率熔解曲线法(HRM法)、Adx-ARMS法、TaqMan探针法和直接测序法检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因(EGFR)的突变情况,并比较各方法的检测效率和敏感性.方法 收集20例肺腺癌石蜡包埋肿瘤组织,其中18例为手术切除标本,2例为穿刺小标本,应用HRM法、ARMS法和TaqMan探针法分别检测EGFR基因突变,对检测结果不一致的样本采用测序法加以验证.结果 20例肺腺癌组织样本中,HRM法、ARMS法和TaqMan法分别在13例、10例和8例组织中检测到EGFR基因突变,差异不显著(P>0.05).差异标本经测序验证后发现,HRM法可检测未知突变,而ARMS法和TaqMan探针法只能检测已知突变.对于2例穿刺小标本,HRM法和ARMS法均检测到突变,而TaqMan探针法未检测出突变,HRM法和ARMs法的检测敏感性高于TaqMan探针法.结论 HRM法、ARMS法、TaqMan探针法和测序法各有优缺点,HRM法敏感性高,且能检测到少见突变与未知突变,因此HRM法结合测序法能更全面的检测出各种突变类型.
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焦磷酸测序法与Sanger测序法检测CYP2C19*17基因多态性方法学对比研究
随着个体化诊断与个性化用药相关研究的进展,由CYP2C19引起的药物氧化代谢个体差异和种族差异越来越引起临床重视,大量内源性底物和临床应用的大约2%的药物均由 CYP2C19催化代谢[1],如对抗癫痫药物[2](丙戊酸和苯妥英钠等)、质子泵抑制剂[3](奥美拉唑、兰索拉唑等)、抗抑郁药[4](西酞普兰等)的代谢影响,其基因多态性是引起同一药物在不同个体和种族间表现出不同代谢能力的主要原因之一[5]。其中,CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17在人群中所占比例较高,前两者相对于酶的活性是下调作用,目前临床检测较为广泛。而 CYP2C19*17对酶的活性是上调作用,等位基因突变占亚洲人群比例为5%。
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国家食药监总局发布三个基因相关产品的分类界定
为适应医疗器械监管工作需要,国家食药监管总局组织有关单位和专家对基因分析仪等3个产品的管理类别进行了界定。现通知如下:
一、作为 III 类医疗器械管理的产品(1个)
基因分析仪:通过对样本中 DNA 或 RNA 分析,检测人基因数量和序列的变化。本产品不用于全基因组测序。分类编码6840。
二、作为 I 类医疗器械管理的产品(1个)
测序反应通用试剂盒(测序法):检测人类基因组 DNA 文库的一组常用试剂和耗材,基于联合探针锚定连接技术的测序原理,与 BGISEQ 基因分析仪配合使用,完成高通量测序过程并获取样本序列信息,是该测序反应系统的通用试剂。本产品不用于全基因组测序。分类编码:6840。 -
全自动荧光标记DNA测序法检测利福平耐药结核杆菌rpoB基因突变
为研究我国分离的结核杆菌临床分离株利福平(Rifampin,RFP)耐药表型与rpoB基因突变的关系,应用全自动荧光标记DNA测序方法对7株RFP耐药株及1株RFP敏感株的rpoB基因突变集中区域进行了序列分析,并与欧美日文献报道结果做了对比.
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合肥地区淋球菌流行株gyrA和parC基因突变位点的分析
淋球菌gyrA和parC基因突变与喹诺酮类药物耐药密切相关.本文用测序法对2002年合肥地区分离的50株淋球菌流行株进行gyrA和parC基因突变位点检测,并与4种喹诺酮类药物的药敏结果比较分析.
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优化聚合酶链反应产物银染测序法鉴定白细胞抗原-DQA1*0102等位基因纯合子
聚合酶链式反应-序列特异引物(PCR-SSP)技术在人类白细胞抗原(HLA)基因分型中被广泛使用.然而,分型过程中常出现"空白基因"而影响整个结果的可靠性.对此,目前多采用DNA测序以确定各等位基因纯合子或存在新突变或结合PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法进行确认[1].我们用PCR-SSP对109名广西巴马县壮族长寿老人和71名对照组进行HLA-DQA1座位基因分型,发现了33个HLA-DQA1*0102/- 个体,经本室优化DNA直接银染测序法[2]测定,确定均为HLA-DQA1*0102/*0102等位基因纯合子,现报告如下.
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焦磷酸测序法检测结直肠癌患者k-ras基因突变
研究证明,k-ras癌基因的激活在CRC发生发展过程中起重要作用[1].k-ras基因常见的激活方式为点突变,其中90%以上的突变发生在1号外显子第12位密码子(野生型:GGT)和第13位密码子(野生型:GGC)[2],突变率约30%~49%[3].近年来,k-ras基因是否突变已成为西妥昔单抗能否用于CRC分子靶向治疗的用药评判标准[4].因此,如何快速准确检出k-ras 基因突变对这类药物的应用及疗效预测显得尤为重要.焦磷酸测序法是一种酶促级联测序技术,特别适用于SNP常规检测[5].
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PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究
焦磷酸测序(Pyrosequecing)技术为近年新一代短片段DNA序列分析技术.国外主要用于分子流行病学的单个核苷酸多态性位点大容量快速检测[1]和临床微生物菌种鉴定与分型[2-3],但国内尚未开展.本研究用该技术对针对不同细菌的独特分子标志,设计基于PCR技术的快速菌种鉴定方法,以提供从分子水平快速鉴定菌种的新的可靠方法.
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PCR-焦磷酸测序法快速鉴定菌血症病原菌
世界范围内成人和儿童菌血症都是高发病率和高死亡率的疾病,每年世界范围内菌血症患者有2 000万例.因病原菌不能鉴定而应用广谱抗生素或不适当抗生素治疗所导致的死亡率非常高,但欧洲每年仍有135 000例患者死于菌血症,在美国更是高达215 000例[1].
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HCV IRES特异性抑制性RNA结构模拟及在体外对病毒翻译启动的抑制作用
[摘要]目的 计算机模拟IRNA二级结构,研究HCV IRES特异性抑制性RNA对HCVIRES介导蛋白翻译的体外抑制作用.方法 应用计算机软件模拟IRNA二级结构;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA,以AatⅡ和Xba Ⅰ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酸载体pGEMRz中;应用酶切方法、PCR方法和测序法对重组载体进行三重鉴定.
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丙型肝炎病毒母婴传播及羊水、乳汁和唾液的作用
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)母婴传播及羊水、乳汁和唾液在母婴传播中的作用.方法:用酶免疫测定(EIA)检测IgG抗-HCV;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV-RNA;Taq DNA聚合酶循环测序法对PCR产物测序.结果:抗-HCV和HCV-RNA均阳性孕妇的24例婴儿中有4例血清检出HCV-RNA,阳性率为16.7%;一对HCV-RNA均阳性母、婴的HCV-cDNA序列同源性为100%;母亲羊水、乳汁和唾液HCV-RNA阳性率分别为25%、16.7%和0%;3例羊水HCV-RNA阳性母亲的婴儿有2例HCV-RNA阳性(66.7%).结论:母婴传播是婴幼儿感染HCV的重要途径,传播率为16.7%.羊水在HCV母婴传播中起重要作用.
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乙、丙型肝炎病毒基因联合诊断芯片的研制及应用
目的:制备一款肝炎病毒检测芯片,能同时实现对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV YMDD变异株及HCV基因型的检测,并与其他检测方法进行比较,以探讨基因芯片技术临床应用的可行性.方法:根据HBV、HCV的序列设计出探针,采用点样法制备芯片.收集HBV DNA阳性和HCV RNA阳性血清各20份,YMDD变异株阳性血清20份,HBV DNA阴性和HCVRNA阴性血清各10份,用基因诊断芯片检测,并与荧光定量法、错配PCR及测序法比较.结果:HBV DNA阳性标本和HCV RNA阳性标本用芯片检测均为阳性;芯片法检测HBV YMDD变异株和错配PCR法的符合率为75%,和测序法的符合率为95%;芯片法检测HCV基因型和测序法的符合率为75%.结论:基因诊断芯片的敏感性和特异性较高,且能检测出不同病毒株的共生状态,但在检测HCV基因型方面存在一定的假阴性和假阳性.
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非小细胞肺癌组织EGFR基因扩增和突变的检测方法比较
目的 表皮生长因子受体(epidermal growth factor recptor,EGFR)基因是非小细胞肺癌(non-small cell lung carcer,NSCLC)治疗的药物靶点,其检测方法有多种,本研究利用荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)、PCR-荧光探针法及测序法分别检测NSCLC患者中EGFR基因的扩增和突变状态,对比3种检测方法的可靠性和临床实用性.方法 收集2008-01-01-2012-01-01山东大学附属千佛山医院行肺部手术的NSCLC患者242例,FISH法检测石蜡切片的EGFR基因扩增状态,PCR-荧光探针法及测序法检测EGFR基因的突变情况,对比分析3种方法所得结果的一致性及其与患者的临床病理学指标的关系.结果 FISH法检测结果显示,242例NSCLC患者中EGFR扩增阳性66例,扩增率为27.27%;测序法结果显示,85例标本存在EGFR基因突变,突变率为35.12%;PCR-荧光探针法结果显示,78例标本中存在EGFR基因的突变,突变率为32.23%.相关性分析结果显示,3种检测结果具有显著相关性,P值均<0.001.EGFR基因的扩增和突变状态均与患者的年龄无关,但女性、腺癌患者明显高于男性、非腺癌患者,P值均<0.001.结论 FISH、PCR-荧光探针法及测序法是检测NSCLC患者EGFR基因扩增和突变的可靠方法,3种方法的协同应用可以准确判断EGFR基因状态,指导EGFR个体化治疗方案的选择及患者预后的评估.
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第二代基因测序诊断产品批准上市
本刊讯2014年6月30日,国家食品药品监督管理总局经审查,批准了BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定连接测序法)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)的医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。
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第二代基因测序诊断产品批准上市
2014年6月30日,国家食品药品监督管理总局经审查,批准了BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定连接测序法)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。该批产品可通过对孕周12周以上的高危孕妇外周血血浆中的游离基因片段进行基因测序,对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行无创产前检查和辅助诊断。国家食品药品监督管理总局高度关注基因测序诊断产业发展,鼓励创新、加强服务,在相关产品注册工作中精心组织、加强协作、严格审评,在确保产品安全、有效前提下,保证了工作的进度。同时,还组织相关技术部门研制完成基因测序诊断产品相关国家参考品,填补了国际空白。
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非小细胞肺癌EGFR19外显子罕见突变病例1例
患者女性,38岁.于2015年初无明显诱因出现咳嗽,咳少量白黏痰伴左胸轻微疼痛.3个月后咳嗽咳痰加重,就诊于潍坊市人民医院,肺部CT示(图1):左肺下叶近主动脉旁见团块影,周围见毛刺征,大截面约3.1 cm×2.3 cm.颅脑CT平扫:各层脑实质未见异常密度影,大小形态正常.入院完善相关检查后2015年7月行手术切除,术后病理诊断:(左肺下叶)中分化浸润性腺癌(图2).行分子病理检测,结果:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因19外显子突变,突变类型c.2251_2276delinsGG(p.T751_I759delinsG).查阅文献及EGFR基因突变数据库,尚未见此突变类型报道,为罕见突变.患者术后给予多个周期化疗,化疗结束3个月后复查胸部CT,较前变化不大.脑MRI:双侧小脑半球及大脑半球可见多发小结节状强化影,考虑颅内多发转移瘤.因化疗效果差,患者选择易瑞沙进行靶向治疗.靶向治疗1年后复查颅脑MRI:仅左额叶见小片状强化信号,较前有明显好转.胸部(肺)CT(图3)较术后未见明显变化.
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李斯特菌FTA卡-16S rRNA测序法鉴定
单增李斯特菌的传统鉴定方法主要是进行生化反应,辅以溶血实验和小鼠毒力试验.这些传统鉴定方法操作复杂、耗时长,鉴定结果易受各种因素影响.近年来各种分子生物学方法开始逐步应用于李斯特菌的检测和鉴定[1-7],其中适用于细菌鉴定的方法只有脉冲电场凝胶电泳(PFGE)法、随机扩增DNA多态性(RADP)法、测序法,但由于操作比较繁琐、操作技术和分析能力要求较高,在实际检测中应用并不多.
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直接测序法与ARMS法检测甲状腺乳头状微小癌组织中BRAF基因突变的比较
目的:探讨直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统( Scorpions amplification refractory mutation system, scorpions ARMS法)检测甲状腺乳头状微小癌组织中( Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)的鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变的特异性和敏感性。方法:采用直接测序法和ARMS法同时检测56例甲状腺乳头状微小癌患者组织中BRAF基因突变情况。结果:56例患者甲状腺癌组织中,直接测序法与ARMS法所检出BRAF基因突变阳性率分别为32.1%和82.9%,敏感度分别为39.1%和100%,前者均显著低于后者( P<0.01)。结论:检测甲状腺乳头状微小癌组织BRAF基因突变时ARMS方法较直接测序法具有更好的敏感性,癌组织小的标本BRAF基因突变检测更适合用ARMS法。
关键词: 甲状腺乳头状微小癌 BRAF基因突变 测序法 蝎形探针扩增阻滞突变系统 -
ABO血型测序法对B(A)血型等位基因的检测分析
自ABO血型系统被发现以来,输血作为一种常规治疗手段在现代医学中发挥着越来越重的作用.ABO血型的标准血清学正反定型方法,因其操作简单和实用等特点得到了广泛地推广.但在疑难血型的判定中存在局限性,应用基因的方法在一定程度上弥补了血清学方法的不足[1,2],为临床安全输血提供了更有力的保障,也为个体识别和人类血型遗传背景研究提供了另外一种手段.