首页 > 文献资料
-
高分辨率熔解曲线分析技术在鼠形动物鉴定中的应用
目的 探索一种能够快速鉴定常见鼠形动物的新型分子生物学方法.方法 以线粒体基因组(mtDNA)细胞色素b(Cytochrome b,Cytb)基因为靶基因,根据GenBank公布的序列,设计测序引物,扩增5种常见鼠形动物的目的基因并测序.依据测序结果和GenBank公布的序列,设计分析引物,进行高分辨率熔解曲线分析.以新鲜提取的基因组DNA为模板,按照1∶10的比例梯度稀释,检测7个浓度梯度,进行敏感性检测.结果 测序引物扩增出5种鼠形动物Cytb序列,分析引物扩增出5种鼠形动物的熔解曲线,并可根据曲线鉴别5种鼠形动物的种类,检测灵敏度为10-2 ng /μl.结论 利用高分辨率熔解曲线分析技术,可以快速准确鉴定5种常见鼠形动物.
关键词： 高分辨率熔解曲线分析 鼠形动物 Cytb基因 -
全自动单核苷酸多态性分析仪检测JAK2基因V617F突变试验的性能评价
目的 根据ISO15189认可要求评价全自动单核苷酸多态性分析仪i-densy IS-5320平台检测骨髓增殖性肿瘤患者JAK2基因V617F突变.方法 仪器性能验证.选择2014 年12月至2017年2月间复旦大学附属华山医院JAK2 基因 V617F 突变阳性外周血标本20 例,JAK2 基因V617F突变阴性的外周血标本20例,以TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR作为对照方法,经测序方法验证评价仪器直接检测全血JAK2基因V617F突变的准确性.使用全血样本分别评估检测平台的检测重复性、携带污染与交叉污染,以及抗干扰能力.取HEL细胞与HCT116细胞为突变型对照和野生型对照,配制12种不同突变细胞比例样本进行检测,以此评价检测突变负荷的能力.结果 i-densy IS-5320平台与TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法检测完全一致;批内重复性与批间重复性为100%;未观察到携带污染与交叉污染;高胆红素(总胆红素:＞20.4 μmol/L)与高甘油三酯(甘油三酯:＞1.8 mmol/L)血样本对突变检测无明显干扰;该平台能够稳定检出负荷低至0.25%的突变.结论 i-densy IS-5320可实现对全血直接进行JAK2基因V617F突变检测,具备较高的灵敏度、准确度和稳定性,操作简便,能够达到临床对突变的检测要求.
关键词： 骨髓增殖性肿瘤 JAK2 V617F 高分辨率熔解曲线分析 -
PR基因G886G多态性与子宫内膜异位症遗传易感性的关联研究
目的 探讨中国南方汉族妇女孕激素受体(progesterone receptor,PR)基因第8外显子区G886G (rs500760)位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与子宫内膜异位症(endometriosis,Ems)遗传易感性的相关性. 方法 收集同期经手术病理证实的431例Ems患者(Ems组)和499例无Ems的妇女(对照组)外周血,采用荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)技术检测PR基因G886G位点SNP,通过病例对照研究评估SNP和Ems的相关性.结果 Ems组和对照组PRG886G位点等位基因A、G分布分别为79.1％、20.9％和79.4％、20.6％,基因型AA、AG、GG分布分别为61.7％、34.8％、3.5％和61.3％、36.1％、2.6％,两组等位基因及基因型分布差异均无统计学意义(P =0.899和0.705).结论 中国南方汉族妇女PR G886G位点多态性与Ems遗传易感性无明显关联.
关键词： 子宫内膜异位症 多态性 单核苷酸 高分辨率熔解曲线分析 -
qPCR-HRM法检测NSCLC组织EGFR突变
目的 比较qPCR-HRM法和测序法检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的差异.方法 收集北京协和医院胸外科2010年6月至2011年7月收治的42例非小细胞肺癌患者的石蜡标本,分别用qPCR-HRM法和测序法检测肿瘤组织EGFR基因突变,使用McNemar检验比较其差别.结果 42例标本qPCR-HRM法检测EGFR突变率为33.3％ (14/42),测序法为28.6％ (13/42),统计学计算未见差异(P=0.5).结论 qPCR-HRM法检测NSCLC组织EGFR基因突变是一种灵敏、可靠的检测方法,可用于体细胞EGFR突变的检测和测序前突变的筛选.
关键词： 肺癌 高分辨率熔解曲线分析 表皮生长因子受体 -
qPCR-HRM法检测NSCLC血清循环EGFR突变
目的 探讨利用qPCR-HRM法检测血清循环EGFR突变的可能性并与组织检测结果比较.方法 收集北京协和医院胸外科2010年6月至2011年7月收治的42例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的石蜡标本及术前静脉血样,用qPCR-HRM法分别检测其EGFR突变情况.结果 42例血样中EGFR突变率35.7％ (15/42),肿瘤组织则为33.3％ (14/42).统计表明血浆和组织中的EGFR突变的检测结果未见差别(P＞0.05).k值为0.842 (P＜0.001).结论 使用qPCR-HRM法检测NSCLC患者血清与肿瘤组织的EGFR突变具有极好的一致性.
关键词： 肺癌 循环DNA 高分辨率熔解曲线分析 表皮生长因子受体 -
儿童急性髓系白血病的核磷酸蛋白基因突变研究
目的 检测儿童急性髓系白血病(AML)患者的核磷酸蛋白(NPM1)基因突变,研究NPM1基因突变在患者中的特点和临床意义.方法 采用高分辨率熔解曲线(HRM)分析法得出样本中NPMI基因突变情况,分析NPM1基因突变与儿童AML患者的临床表现和预后的关系.结果 70例初诊儿童AML患者NPM1突变率为45.7%.NPM1突变组外周血血小板计数明显高于NPM1野生组(P=0.013).正常核型组与异常核型组突变率差异无统计学意义(P>0.05).AML-ETO或PMLRARα融合基因阳性组突变率低于融合基因阴性组(P=0.048).与NPM1野生组相比,NPM1突变组相对缓解率、5年无事件生存(EFS)率、5年总体生存(OS)率相对较高,但两组差异无统计学意义(P值分别为0.217、0.374、0.380).结论 该组病例中,NPM1基因突变阳性率较高.NPM1突变组和NPM1野生组在临床各项指标的差异不大,NPM1突变组的预后相对较好,但两组的差异无统计学意义.
-
PCR-HRM分析筛查成骨不全一家系患儿基因突变
目的：采用PCR-高分辨率熔解曲线（HRM）分析筛查成骨不全（OI）一家系患儿（先证者）COL1A1基因突变位点，探讨其基因型与临床表型的联系。方法对先证者进行家族史及临床资料的调查，采集先证者、家属及50名正常对照者血液标本，应用PCR-HRM分析筛查先证者及正常对照者COL1A1基因突变，基因测序确证突变位点。结果先证者COL1A1基因17外显子筛查结果异常，其熔解温度（Tm）值比正常对照者Tm值低约0.4℃。先证者与正常对照者的标准熔解曲线及差异熔解曲线均有明显差异。测序结果为c.1138G>A，突变导致380位氨基酸由甘氨酸（Gly）变成丝氨酸（Ser）：p.（Gly 380 Ser），为错义突变。先证者父亲、祖母均具有相同突变位点。先证者母亲及正常对照者基因测序结果无此突变。该突变在中国人群中未见报道。该家系遗传特征为常染色体显性遗传，先证者临床诊断为Ⅳ型OI，临床表型较严重。结论 PCR-HRM分析是有效的OI基因筛查新方法。COL1A1基因c.1138G>A突变在中国人群中为新发现的突变位点。α螺旋结构域Gly被替换可能导致较严重的临床表型。
-
建立高分辨熔解曲线分析法检测SF3B1基因突变
目的:建立高分辨熔解曲线分析法(high-resolution melting analysis,HRMA),检测骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中SF3B1基因的突变.方法:针对SF3B1基因热点突变位点(密码子E622、H662、K666和K700)设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增反应体系,对30例初诊MDS患者的骨髓标本进行PCR扩增,应用HRMA对相应PCR产物进行突变检测,并对HRMA检测结果进行DNA测序验证.结果:HRMA检测发现2例MDS患者存在异常的熔解曲线,经DNA测序验证1例为K666M杂合子突变,另l例为K700E杂合子突变.所建立的HRMA技术检测SF3B1基因突变的灵敏度为0.05(5％).结论:成功建立检测SF3B1基因突变的HRMA技术,可快速筛查MDS标本中的SF3B1基因突变.
关键词： 高分辨率熔解曲线分析 SF3B1 基因突变 骨髓增生异常综合征 -
高分辨率熔解曲线分析法检测胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶1基因突变
目的 采用高分辨率溶解曲线分析法检测胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶1(IDHl)基因突变,探讨其应用于临床检测的可行性.方法 首先采用高分辨率溶解曲线分析法检测9例胶质瘤患者中IDH1基因·的突变情况,并以直接测序法对结果进行验证.结果 通过高分辨率熔解曲线分析法,确认9例胶质瘤患者中有6例发生了IDH1突变,其中5例为R132H(CGT＞ CAT),l例为R132C(CGT＞ TGT),其余检测均为野生型.经直接测序对以上9例标本进行验证,证实所有患者的突变情况与高分辨率熔解曲线分析法的结果一致.结论 应用高分辨率熔解曲线分析法检测临床样本IDH1突变与直接测序法比较具有操作简便、快速、结果准确的优点,适合在临床开展.
关键词： 胶质瘤 突变 IDH1基因 高分辨率熔解曲线分析 -
高分辨率熔解曲线分析对38例孤独症DRD2基因外显子突变检测
目的 对孤独症患者DRD2基因全部外显子进行突变筛查.方法 构建孤独症患者纳入研究组(38例)和对照组(95例和1 000例)3个DNA混合池,对DRD2基因的9个外显子合成了15对引物,将3个DNA混合池样本分别进行聚合酶链扩增及COLDPCR扩增,用Light Scanner高分辨率熔解曲线分析系统进行两次熔解曲线对比.结果 在孤独症患者DRD2基因外显子未发现突变.结论 孤独症的病因并非源于DRD2基因外显子的突变.
关键词： 孤独症 DRD2 基因 突变 低变性温度下的复合PCR 高分辨率熔解曲线分析 -
抑郁症多巴胺受体DRD2基因突变检测
目的 对抑郁症患者DRD2基因外显子进行突变筛查.方法 对DRD2基因的9个外显子设计合成15对引物,将238例抑郁症患者分为3组,分别构建3个DNA混合样本(96例、96例与46例).将1 095例正常对照者分为两组,分别构建2个DNA混合样本(95例和1 000例).将上述5个DNA混合样本作为DNA模板,先对其进行聚合酶链扩增,用Light Scanner高分辨率熔解曲线系统(HRM)筛查突变并确定TC值；对PCR产物稀释40倍后作为模板进行COLD-PCR扩增后再进行HRM突变检测.结果 对患者组与两个对照组熔解曲线逐一对比后未发现患者DRD2基因外显子存在突变.结论 抑郁症的病因并非源于DRD2基因外显子的突变.
关键词： 抑郁症 DRD2 基因 突变 高分辨率熔解曲线分析 -
应用高分辨率熔解曲线技术检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因变种stx2c
目的:探索高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析技术在检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因变种stx2c中的应用.方法:用HRM技术对20株O157:H7代表性菌株志贺毒素2基因进行分型,并与测序结果进行比较.结果:20份O157:H7样品中有3种类型熔解曲线.测序结果显示,12例A型熔解曲线中除1例为stx2a+stx2c杂合型外,其它均为原毒素基因型stx2a；1例B型熔解曲线测序结果为stx2a+stx2c杂合型,7例C型熔解曲线菌株测序结果均为stx2c纯合子.结论:HRM技术简便、快速,可作为志贺毒素2基因变种stx2c的检测方法.
-
成骨不全家系患者相关基因突变筛查及分析
目的 筛查4例成骨不全(OI)家系先证者Ⅰ型前胶原α链基因(COL1A1/COL1A2)基因突变,分析基因型与表型的关系.方法 收集先证者及家系成员临床资料,采集先证者、家系成员及50例正常对照的血液标本.采用聚合酶链反应(PCR)-高分辨率熔解曲线分析(HRMA)筛查先证者COL1A1/COL1 A2基因突变,基因测序确定突变位点.结果 HRMA显示先证者1分别在COL1A2基因12外显子、19外显子区域结果异常,标准熔解曲线与正常对照存在明显差异.测序结果,先证者1分别在COL1 A2基因12外显子、19外显子及18内含子发生突变:c.578G＞T、c.948 C＞T、c.937-3T＞C;其中c.948 C＞T、c.937-3T＞C为单核苷酸多态性(SNP)位点,c.578G＞T为新发现的突变位点.先证者2、3、4,分别在COL1 A2基因的38外显子、COL1A1基因的6外显子、23外显子区域的标准熔解曲线与正常对照存在明显差异.测序验证先证者2 COL1 A2基因突变:c.2305 G＞T.先证者3、4均在COL1A1基因发生突变:c.517 G＞T、c.1588 G＞A.其中先证者3 COL1A1基因c.517 G＞T为新发现的突变位点.先证者1、2、4基因突变,导致Ⅰ型胶原蛋白3股螺旋区域甘氨酸(Gly)被替换,可引起较为严重的表型,先证者3的无义突变,可造成Ⅰ型胶原合成量的改变,临床表型较轻.结论 患者COL1A2基因c.578 G＞T、COL1A1基因c.517 G＞T均为新发现的突变位点,患者的基因型与临床表型存在一定的联系.
关键词： 成骨不全 基因诊断 高分辨率熔解曲线分析 基因型 表型 -
高分辨率熔解曲线法检测中国5种常见β-地中海贫血突变
目的 探讨高分辨率熔解曲线法(HRM)检测中国5种常见β-地中海贫血突变的可行性.方法 应用HRM法检测中国5种常见β-地中海贫血突变,检测结果为纯合子的标本进行基因测序验证.结果 HRM法能准确区分-28(c.-78A＞G)、Codon17 (c.52A＞T)、Codons41/42 (c.126_129delCTTT)、Codons71/72 (c.216_217insA)及IVS-Ⅱ-654(c.316_197C＞T)的纯合、杂合突变以及野生型标本,测序结果与HRM法检测结果一致.结论 HRM法检测中国5种常见β-地中海贫血突变具有简便、快速、灵敏度高等优点,有望成为临床尤其是产前诊断领域β-地中海贫血突变筛查的优选方法.
关键词： 高分辨率熔解曲线分析 基因突变 β-地中海贫血 -
不同操作平台、染料间高分辨率熔解曲线分析技术检测烘便基因突变的性能差异
目的 探讨在不同操作平台、染料间高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术检测粪便基因突变的性能差异.方法 收集合格的粪便125份,其中大肠癌40份,晚期腺瘤35份,正常对照50份,在LightCycler 480与Rotor-Gene 6000平台设备上,分别使用Resolight或Eva Green染料,检测K-ras基因突变率的差异,所有样品均行测序.结果 测序发现,大肠癌组、晚期腺瘤组、正常对照组K-ras基因突变率分别是40%、31.4%、0%.在LightCycler 480平台,用Resolight/Eva Green染料突变检出率分别为40%/45%、31.4%/34.2%、0%/0%.在Rotor-Gene 6000平台,用Resolight/Eva Green染料突变检出率分别为42.5%/47.5%、34.2%/37.1%、0%/0%.在各组中,不同操作平台、染料间突变检出率差异无统计学意义(P>0.05).HRM检测粪便基因突变敏感度达100%.结论 HRM在不同操作平台、染料间的突变检出率差异无显著性.
关键词： 高分辨率熔解曲线分析 粪便基因突变检测 操作平台 染料 -
高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便基因突变与临床病理参数的关系
目的 初步探讨高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便DNA突变与临床病理参数的关系.方法 收集2009年3月～2009年9月在本院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1 g,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、P53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析.结果 大肠癌患者粪便中APC、K-ras、P53基因的突变与大肠癌患者性别、年龄、分化状态、病变部位、Dukes分期和有无淋巴结转移无关.结论 未发现粪便APC、K-ras和P53基因突变情况与大肠癌患者的临床病理参数具有相关性.
-
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速分型方法的研究
目的：基于聚合酶链反应（PCR）-高分辨率熔解（HRM）曲线分析方法和葡萄球菌蛋白A（SPA）分型方法，建立一种适用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的快速分型方法。方法收集临床分离的71株MRSA作为试验菌株，采用基因测序和HRM曲线分析方法对菌株进行 SPA基因分型。结果采用基因测序方法，71株MRSA菌株的 SPA基因分为4个型别，分别是t570、t030、t002和t588，以t570（53例）为主要型别，其次是t030和t002（均为7例）。HRM分析对 S PA基因的分型结果与基因测序方法的结果基本一致。结论 PCR-HRM分析有望成为一种快速、有效的MRSA的 SPA基因分型方法，为医院感染控制提供依据。
-
IL-6634C/G基因多态性与子宫内膜异位症易感性的相关研究
目的 探讨中国南方汉族妇女白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因启动子区634C/G (rs1800796)位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与子宫内膜异位症(endometriosis,Ems)遗传易感性的相关性.方法 收集经手术证实的432例Ems患者和499名对照人群外周血,采用荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting,HRM)技术检测IL-6 634C/G基因SNP.结果 IL-6 634C/G位点等位基因、携带等位基因G及其基因型的分布在Ems组和对照组间差异均有统计学意义(P=0.032、0.014和0.045),其中等位基因C使Ems发病风险提高1.057倍,而等位基因G使其降低0.835倍；携带等位基因G使Ems发病风险降低0.822倍,而不携带使其提高1.143倍；CG与CC基因型相比患Ems的危险度低0.704倍(95％CI:0.533～0.931).但IL-6 634C/G位点携带等位基因C的分布在两组间差异无统计学意义(P=0.729).结论 中国南方汉族妇女IL-6 634C/G位点SNP与Ems遗传易感性存在相关性.
关键词： 子宫内膜异位症 白细胞介素-6 单核苷酸多态性 高分辨率熔解曲线分析 -
CYP1B1 432C/G基因多态性与子宫内膜异位症易感性的相关研究
目的 探讨中国南方汉族妇女CYP1B1基因第3外显子432C/G (rs1056836)位点单核苷酸多态性(single nueleotide polymorphism,SNP)与子宫内膜异位症(endometriosis,Ems)遗传易感性的相关性.方法 收集经手术证实的432例Ems患者和499例对照人群外周血,采用荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting,HRM)技术检测CYP1B1 432C/G基因SNP.结果 病例组和对照组妇女CYP1B1 432C/G位点CC、CG、GG基因型频率分别为80.6％、18.8％、0.7％以及77.6％、21.0％、1.4％,2组的基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.376)；C和G等位基因分布为89.8％、10.1％以及88.1％、11.9％,2组差异无统计学意义(P＞0.376).结论 中国南方汉族妇女CYP1B1 432C/G位点SNP与Ems遗传易感性无明显相关性.
-
高分辨率熔解曲线分析技术及其在法医学中的应用
高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术是一种利用DNA杂交与退火熔解特性进行核酸分析的技术,主要通过对DNA解离活动中荧光染料变化的监控,实现突变的筛查和检测.HRM分析技术不需要探针标记,并且能够在很大程度上减少测序的负担,具有特异性好、通量高、时间成本低、便于操作等优点.HRM分析技术还是一种同质闭管的检测方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与后续检测均在同一孔内完成,无需转移样品,能有效的减少交叉污染的可能性.近年来有越来越多的专家学者尝试将HRM分析技术应用于法医学研究和相关案例中.本文拟对高分辨率熔解曲线分析技术的原理、技术特点、局限性以及在法医学中的应用进行综述.
关键词： 法医物证学 高分辨率熔解曲线分析 基因分型
