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生物素化壳聚糖纳米粒的制备及其相关性质
制备了生物素化的壳聚糖纳米粒(biotinylated chitosan nanoparticles,Bio-CS-NP)并测定其相关性质,以此作为抗癌药物的载体.制备过程为:先用磺酸琥珀酰亚胺生物素与壳聚糖反应生成生物素化的壳聚糖(biotinylated chitosan,Bio-CS),再采用氯化钠沉淀法制备Bio-CS-NP.采用试剂盒测定Bio-CS-NP表面配体连接密度,用透射电镜和激光粒度分析仪分别检测纳米粒的形态和粒径,并比较了人肝癌HepG2细胞对Bio-CS-NP和未经生物素修饰的壳聚糖纳米粒(chitosan nanoparticles,CS-NP)的摄取情况.结果显示,Bio-CS-NP表面配体连接密度为2.2 biotin CS;纳米粒形态为圆球形,表面光滑,平均粒径为296.8 nm,多分散指数为0.155;HepG2细胞对Bio-CS-NP的摄取能力显著高于CS-NP(P＜0.05).以上研究结果表明Bio-CS-NP有望成为一种新型的药物载体,用于抗癌药物对癌细胞的主动靶向.生物素的检测方法简便、可行.
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应用催化信号放大法检测Bcl-2、Bcl-XL蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其意义
在石蜡切片的免疫组化染色中,常因被检测的抗原遭到甲醛等常用固定剂的破坏而影响到免疫组化染色效果,为此,人们一方面通过对石蜡切片进行酶消化或热处理使免疫组化检测敏感性提高,另一方面通过提高检测系统的敏感性来克服这一限制.催化信号放大(catalyzed signal amplification, CSA)法是一种新颖的,此传统的ABC、LSAB、SP法更敏感的检测系统,在我们早期的研究中称其为生物素标记酪氨法(biotinatilyted tyramine, BT法)[1].该方法的特点是利用生物素化酪氨分子结合到HRP(辣根过氧化酶)的催化位点上来达到增强信号的目的.近来,我们利用该方法的高敏感性检测了一系列凋亡相关蛋白在各类非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达和分布.Bcl-2和Bcl-XL均为Bcl-2家族成员,是目前比较公认的抗凋亡蛋白,在细胞凋亡过程中起着重要的调控作用.我们应用CSA法检测Bcl-2和Bcl-XL蛋白在NHL中的表达,以探讨其在NHL发生和发展机制中的作用.
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免疫PCR检测沙门菌方法的建立及其应用
1992年Sano等人[1]首次报告用免疫PCR方法检测微量的牛血清白蛋白.该方法将PCR技术的高敏感性与抗原抗体反应的持异性结合起来,具有极高的敏感性和特异性,更使PCR技术应用于对蛋白等非核酸类物质的检测.髓后的报道大都用于检测HBsAg[2]、TNF[3]等可溶性蛋白.本文利用链亲和索和生物素之间的高度亲和力,采用生物素化羊抗鼠IgG作二抗,将单抗与DNA相连接,建立免疫PCR检测方法,用以检测颗粒性抗原细菌,并与ELISA方法进行了比较.
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基于 Avi-tag技术的双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白
目的：利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白（ EGFP）。方法：PCR方式扩增EGFP基因片段，重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体 pdi-Avitag，构建原核表达载体pEGFP-（Avitag）2并转化E.coli DH5α；表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-（ Avitag）2，以BirA酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接，并以 Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果：成功构建pEGFP-（Avitag）2载体，并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-（Avitag）2，经Western blot和竞争ELISA鉴定， EGFP-（ Avitag）2分子经BirA酶体外催化可连接两个生物素分子。结论：成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白，为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。
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sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测
目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术.方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体.获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证.结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合.结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体.为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法.
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HCV核心抗原N-端片段生物素化表达质粒的构建及表达
目的 构建HCV核心(C)抗原N-端1～130 aa片段的生物素化表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达.方法 PCR扩增HCV C抗原N-端1～130 aa片段的编码基因,拼接上生物素-蛋白连接酶底物肽序列(BSP),构建重组原核表达质粒pGEX4T-1-CN130BSP,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE后,电转至硝酸纤维素膜上,以抗HCV C抗原的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素对表达产物进行分析.结果 PCR扩增出约466 bp的目的 基因片段;质粒pGEX4T-1-CN130BSP经PCR及双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定基因无突变;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为42 000,22℃诱导16 h可溶性表达产物含量较高;表达的重组蛋白可被抗HCV C抗原的单克隆抗体所识别,并能特异性结合辣根过氧化物酶标记的亲和素.结论 已成功构建了HCV C抗原N-端1～130 aa片段生物素化表达质粒,并表达出带生物素标签的GST融合蛋白,为进一步研制HCV双抗原夹心检测试剂奠定了基础.
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亲和素促排减轻荷瘤裸鼠放免治疗毒副作用的实验研究
本研究将188Re标记生物素化单克隆抗体(McAb-Bt)和亲和素(Av)用于荷人结肠癌裸鼠模型,评价其在肿瘤放免忖治疗(RIT)中的价值,现报道如下.
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生物素化壳聚糖材料的合成及表征
目的 合成生物素化壳聚糖并对其结构进行表征.方法 以壳聚糖为基本原料,以4-二甲基氨基吡啶、二环已基碳酰胺为催化剂将壳聚糖的氨基上引入生物素,经透析精制,冷冻干燥后得到新的靶向载体材料-生物素化壳聚糖.采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振氢谱(1HNMR)和差示扫描量热法(DSC)对产物进行结构表征.结果 精制后得到的白色粉末状固体生物素化壳聚糖材料,其结构与各单体的FTIR、1HNMR、DSC出现了明显的差别.产品收率为14.95%,其生物素的取代度约为48.28%.结论 生物素与壳聚糖成功地以酰胺键连接在一起,合成了生物素化壳聚糖.该方法合成工艺简单,生产成本低.
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外源性α晶状体蛋白作用于视网膜神经节细胞的定位研究
背景 视神经损伤后无法有效再生,而近年研究发现,α晶状体蛋白能显著促进视网膜神经节细胞(RGCs)的存活及轴突有效再生,但其分子机制尚不清楚.目的 研究外源性α晶状体蛋白与RGCs的结合部位.方法 从2只2 d龄Long Evans大鼠视网膜中分离并原代培养RGCs,应用thy1.1和cy3抗体荧光染色技术对培养的RGCs进行鉴别并在荧光显微镜下计数RGCs阳性率.对外源性的α晶状体蛋白生物素化后用直接显色法进行鉴定,并用胰岛素实验对其分子伴侣活性进行测定,明确α晶状体蛋白生物素化成功并具有分子伴侣活性后与原代培养的RGCs共孵育,再与荧光标记的亲和素进行反应,在激光共焦显微镜下观察外源性α晶状体与RGCs的结合部位.结果 原代培养的RGCs阳性率为94%;生物素化α晶状体蛋白直接显色法鉴定整体显色强,其A450值随生物素化的α晶状体蛋白的浓度下降而下降,提示α晶状体蛋白生物素化成功;生物素化α晶状体蛋白的分子伴侣活性明显,且生物素化前后活性无明显改变;生物素化α晶状体蛋白与RGCs共孵育及荧光染色后,激光共焦显微镜下与生物素化α晶状体蛋白共孵育的RGCs细胞膜和轴突均可见红色荧光,细胞质和细胞核未见荧光染色.对照组RGCs未见荧光染色.结论 外源性的α晶状体蛋白特异性地结合在RGCs细胞膜上,提示外源性的α晶状体蛋白通过与RGCs细胞膜特异性结合而发挥相应的生物学功能,但其结合方式及作用机制需进一步研究.
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可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化
目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化.方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体.利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2 m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物.然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL).结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化.应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体.结论 HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具.
关键词： HLA-A*2402-pBRLF1复合物 生物素化 BirA酶 四聚体 -
99mTc-CL3-Bt的制备、质控及生物分布研究
目的 制备99mTc-CL3-Bt并对其质量控制、生物分布进行研究。方法 将单抗CL3生物素（Bt）化，以2-巯基乙醇（2-ME）还原后以直接法进行99mTc 标记。以细胞结合实验测定并比较99mTc-CL3-Bt 和99mTc-CL3的免疫活性；然后将两种标记物注入荷大肠癌裸鼠模型，6 h后处死裸鼠，计算并比较99mTc-CL3-Bt 和99mTc-CL3在体内的每克组织摄取分数（ID%/g）值和肿瘤ID%/g/其它组织ID%/g（T/NT）比值。结果99mTc-CL3-Bt和99mTc-CL3的细胞结合率分别为90%、94%；在瘤体的ID%/g值分别为（6.3±1.1）、（6.7±0.9），二者无显著差异（t=0.6293, P>0.05）；瘤/血比值分别为（0.70±0.24）、（0.80±0.12），二者亦无显著差异（t=0.8333, P>0.05）。结论 99mTc-CL3-Bt免疫活性高，能特异性被肿瘤摄取，可广泛用于临床放射免疫显像研究。
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029 心肌肌钙蛋白Ⅰ水解对免疫检测可信度的意义
文章通过不同免疫学方法分析坏死心肌和血清肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)水解过程对免疫检测方法的影响.使用一步夹心法的生物素化单克隆抗体(mAbs)为捕获抗体、鳌合Eu3+mAbs为检测抗体,mAbs(除6F9外)对cTnI有特异性;急性心梗(AMI)病人血清和取自四位AMI卒中捐献者的左心室组织经凝胶电泳和Western印迹了解其N末端氨基酸残基序列和cTnI及其水解片段.
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抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定
目的 筛选生物素化三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究相关快速检测试剂盒创造条件.方法 本试验利用生物素化三聚氰胺为包被抗原,从半合成噬菌抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体片段.即采用菌噬体表面展示技术,以链亲和素-生物素标记的三聚氰胺为固相包被靶抗原,把靶抗原包被在免疫平板上,加入噬菌体抗体库,则头部带有能与靶抗原特异性结合的抗体分子的噬菌体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉;将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠杆菌,就可以得到含抗体基因的噬菌粒.结果 从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程后,获得抗原特异性和结合性较强的生物素化三聚氰胺scFv片段.结论酶联免疫吸附试验等进行鉴定后,筛选得到了抗生物素化三聚氰胺的噬菌体抗体基因片段,为下一步亲和力鉴定、蛋白表达及开发相关检查试剂盒奠定了基础.
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生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备
目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物.方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体.利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人β2微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物.结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化.结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础.
关键词： HLA-A*2402-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶 -
用免疫组化ABC法的漂片法做好脑片实验的体会
ABC法是将亲和素作为桥,把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来.首先,以Ⅰ抗与组织切片共孵育,使特异性Ⅰ抗与组织中的相应抗原结合,之后加上生物素标记的Ⅱ抗,Ⅱ抗与Ⅰ抗通过抗原-抗体反应结合,后加入ABC复合物,Ⅱ抗上的生物素则与ABC复合物中的亲和素上空下的位点结合.用ABC法中的漂片法做脊髓冰冻切片的染色比较容易做出结果,但如果是用此法做大鼠脑的冰冻切片染色则较难做出结果,特别是做出漂亮的脑片更难.作者在用ABC漂片法做脑组织冰冻切片的免疫组织化学实验的过程中,通过改变常规的操作步骤环节,使做出的脑片质量大为提高.以下实验技术介绍的是将免疫组化ABC法的漂片法用于脑组织冰冻切片中的几点体会.
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环孢嘌呤A影响大鼠心脏移植中fractalkine表达的免疫组化研究
目的研究大鼠心脏移植中fractalkine的表达以及环孢嘌呤A抗免疫排斥的作用,并探讨该作用的可能机制.材料和方法 1.动物:成年雄性SD大鼠和Wistar大鼠, 体重约200克/只.2.大鼠同种异体心脏移植模型:取供者SD大鼠心脏,结扎上腔静脉和肺静脉.打开受者Wistar大鼠腹腔,结扎腰动脉以及下腔静脉的分支.分别将供者主动脉与受者腹主动脉、供者肺动脉与受者下腔静脉做端侧吻合,并于术后分为三组:Ⅰ组(对照组)、Ⅱ组(CsA7.5mg/KgB.W.)和Ⅲ组(CsA 15mg/Kg B.W.).每组样本7例(n＝7),分别于1d、3d、7d和11d取移植心脏以及供者主动脉,脱水包埋或液氮冻存.3.H.E染色及排异分析:石蜡切片,常规H.E染色,依据国际心肺移植组织(ISHLT)1990年心脏急性排异反应分级标准进行排异反应分析.4.免疫组织化学染色:石蜡或冰冻切片,常规免疫组化方法检测ICAM-1 的表达:fractalkine一抗(羊抗鼠),二抗(驴抗羊),ABC试剂盒(均为Sa ntaCrus公司产品).先以3%H2O2、柠檬酸钠微波抗原修复后,PBS洗三次,加1.5%驴血清封闭,分别加一抗、生物素化二抗、亲合素-生物素化酶试剂DA B显色.以PBS及fractalkine的同型抗体作阴性对照.结果心脏移植后1和 3天,供者心脏和主动脉出现轻度炎性浸润,排异反应为1A或1B级;11天和12天时出现弥漫性炎性浸润和心肌坏死,并伴明显水肿、出血以及血管炎,排斥级别达3B或4 级.CsA治疗可使移植排异降低1～2.5级.移植后,血管内皮细胞和外膜浸润淋巴细胞的fractalkine表达显著升高,并有血管平滑肌细胞和间质成纤维细胞出现较强阳性反应.CsA治疗可明显抑制移植的心脏及主动脉的fractalkine表达. 该抑制作用在1至3天内,呈CsA剂量依赖性,而在7至11天与剂量无关.结论 Cs A治疗是下调淋巴细胞迁移和浸润、减弱移植排斥反应的有效手段,其机理可能与降低趋化蛋白表达有关.
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生物素化抗AIB1单克隆抗体的制备及应用研究
目的 用生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)对纯化抗AIB1单克隆抗体1A2E1进行标记,并应用标记后单克隆抗体对靶细胞中AIB1蛋白进行检测.方法 用BNHS与纯化抗体1A2E1交联,制备Biotin-1A2E1,用竞争抑制ELISA法及免疫细胞化学法检测Biotin-1A2E1的生物学活性.结果 所制备的生物素化抗体活性高,效价为1∶3200,用于检测乳腺癌细胞中AIB1蛋白敏感性好. 结论 成功制备生物素化抗体Biotin-1A2E1,并可初步应用于靶细胞AIB1蛋白的检测,为肿瘤辅助诊断中AIB1蛋白的检测提供有力手段.
关键词： 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯 生物素化 单克隆抗体 AIB1 -
BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定
目的: 构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶.方法:用PCR法扩增BirA酶基因.将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA.经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化.以带有生物素酶底物肽(BirA substratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Western blot鉴定表达产物的生物素化活性. 结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61 300 的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白. ELISA和Western blot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化. 结论: 成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂.
关键词： BirA酶 生物素化 HLA-A2-肽复合物 -
可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化
目的: 可溶性HLA-A2-抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化.方法: 原核高效表达的HLA H链及β2m, 在抗原肽(EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2-CLGGLLTMV-COOH残基)的存在下, 通过稀释复性折叠成HLA-A2-抗原肽复合物, 并在BirA酶的作用下进行生物素化, 使生物素结合到HLA-A2-抗原肽复合物中的H链C端.利用特异性抗体 (mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot, 检测稀释复性和生物素化的折叠产物. 结果: 折叠复合物中, 主要含有HLA H链聚合体、HLA-A2-肽复合物单体及β2m 3种成分, 其中H链聚合体与HLA-A2单体可生物素化.结论: 成功地获得生物素化的HLA-A2-抗原肽复合物单体, 为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础, 也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体的制备提供了可行的免疫学监控方法.
关键词： HLA-A2-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶 -
HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用
目的:构建2种HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体,并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL).方法:原核高效表达HLA-A*2402-BSP和β2m蛋白后,分别与乙型肝炎病毒抗原肽Po1756-764和Core117-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A*2402抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体.后进行流式细胞术检测.结果:Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物单体.结论:构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL.
关键词： HBV抗原肽-HLA-A*2402单体 T淋巴细胞 生物素化
