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谷氨酸转运抑制剂对大鼠培养脑片皮层锥体细胞的影响
目的观察谷氨酸转运抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)对大鼠培养脑片中大锥体细胞的影响,探讨谷氨酸在皮层运动神经元损伤中的作用.方法取出生后1 d SD乳鼠的运动区大脑切片培养,用含有不同浓度THA的培养液进行干预,培养后的脑片用神经元特异性免疫组化染色剂SMI-32(抗非磷酸化神经丝抗体)染色,对皮层大锥体细胞进行鉴定、计数,透射电镜观察超微结构,并测定不同时点培养液中谷氨酸(Glu)的含量.结果对照组脑片大锥体细胞数目稳定,而THA可以引起剂量依赖性培养液中Glu含量的升高及大锥体细胞数目减少,空泡变性.结论细胞外谷氨酸增高对大锥体细胞造成慢性损伤.
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用于膜片钳记录的脑片制备方法
目的 探索用于膜片钳记录的脑片制备方法并分析鼠龄、溶液、操作过程等因素对神经细胞活性的影响.方法 取各年龄段的Sprague-Dawley大鼠60只,麻醉后快速断头取脑,冰镇后取出并修块,用振动切片机切取300 μm下丘脑冠状脑片,人工脑脊液33℃孵育45min后,在红外微分干涉相差显微镜下观察脑片神经元.结果 镜下可观察到状态良好的神经元(边界清晰、立体感强、细胞核和颗粒不可见),神经元活性的好坏与实验条件和实验操作有关.结论 鼠龄、溶液、实验操作等因素与脑片神经元活性密切相关,实验过程中需要严格控制各种实验条件.
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缺血再灌注损伤对SD乳鼠器官型脑片神经再生的影响
目的 探讨缺血再灌注损伤对SD乳鼠器官型脑片中神经再生的影响.方法 制备P3 SD乳鼠的全脑器官型脑片,随机分为缺血再灌注组和正常对照组,观察脑片生长情况,培养3天后,两组再分别分为2个亚组,分别给予药物和空白干预,依次列为I组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组,通过倒置显微镜及免疫荧光染色观察各组脑片在1、3、7天的改变.结果 缺血再灌注组室下区、海马齿状回可见巢蛋白阳性新生细胞,而正常对照组未见新生细胞;药物干预后,两组均出现大量新生细胞,但正常对照组单位区域新生细胞数量多于缺血再灌注组(P<0.01);Ⅲ组较I、Ⅱ组明显增多(P<0.01),随着培养时间延长,两组新生细胞均向外迁移,上述区域新生细胞密度逐渐减少.结论 缺血再灌注损伤可以促进SD乳鼠器官型脑片神经再生,但同时也损伤了神经再生的潜能.
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成年大鼠丘脑底核离体脑片的制备方法
目的 建立一种制备健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠丘脑底核(subthalamic nucleus,STN)离体脑片的方法.方法 选取成年SD大鼠,体重280～450 g,给予大鼠4℃氯化胆碱切片液主动脉灌流后取脑,取脑时间尽量控制在30 s内,振动切片机制备含有STN的冠状脑片.同时采用其他保护脑片细胞活性的措施,如人工脑脊液中添加抗氧化剂,脑片制备全程注意保持低温冰浴状态等.利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法观察神经元活性.通过红外微分干涉相差显微镜(IR-DIC)观察脑片的神经元形态.全细胞膜片钳记录大鼠STN神经元的电生理学指标.结果 40倍镜下显示,大量STN神经元轮廓清晰、表面光滑、饱满、有立体感,PI染色为阴性.进行全细胞膜片钳记录时,封接顺利,获得的STN神经元电生理指标如下:静息膜电位为(-46.4±1.26)m V,膜电阻为(493.1±62.29)MΩ,有自发放电的神经元占记录细胞总数的43.8％(28/64),动作电位阈值为(-28.30±1.20)mV,动作电位幅度为(68.00±2.27)mV,动作电位半宽为(0.80±0.06)ms,基强度为(42.0±6.09)pA.结论 本方法制备的成年SD大鼠STN离体脑片保证了STN神经元的活性,适用于诸如帕金森病等神经系统退行性疾病动物模型离体机制研究.
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仙人掌多糖组分对大鼠脑片氧化应激损伤的保护作用
目的 研究仙人掌多糖对H2O2所致大鼠大脑皮质和海马脑片氧化应激损伤是否有保护作用.方法 大鼠离体皮质和海马脑片与2 mmol·L-1 H2O2共孵育30 min造成脑片的氧化应激损伤,分别于加入H2O2前加入仙人掌多糖作用30 min,与H2O2同时加入仙人掌多糖作用30 min或在H2O2损伤之后加入仙人掌多糖作用2 h.TTC染色法检测脑片活性,并检测脑片培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,谷胱甘肽(GSH)含量和总抗氧化能力(T-AOC).结果 H2O2孵育30 min明显损伤大鼠海马和皮质脑片,TTC染色A490 nm值下降,LDH释放增加,GSH含量和总抗氧化能力降低.加入H2O2前预先加入仙人掌多糖 0.333和1.67 mg·L-1作用30 min显著抑制上述H2O2所致脑片损伤,使受损脑片孵育液中GSH含量增加,SOD活性和总抗氧化能力升高.结论 仙人掌多糖能够减轻H2O2所致大鼠大脑皮质和海马脑片的氧化应激损伤,其机制可能与其增强机体的抗氧化能力有关.
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注射用头孢吡肟致大疱表皮松懈症死亡1例
病例:患者,男,76岁.因"左侧肢体无力,口齿不清2小时"于2009年4月11日入院.头颅CT示:右侧丘脑出血;脑片示:双肺稍增多;心影正常.诊断为"右侧脑出血,急性支气管炎,高血压病Ⅱ级".在院外曾口服"血塞通、肠溶阿司匹林".
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神经保护药和抗炎药对小鼠脑片缺氧缺糖/再灌损伤的作用
目的在离体脑片缺血性损伤模型上,建立筛选与评价神经保护药和抗炎药的方法.方法小鼠离体脑片缺氧缺糖/再灌诱导(OGD/RP)的模型上,以2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)产物formazan定量测定评价脑片活性,观察不同药物离体给药或整体预给药7 d对脑片损伤的保护作用.结果抗氧化剂依达拉奉、钙拮抗剂尼莫地平及神经生长因子可显著减轻脑片的缺血性损伤;半胱氨酰白三烯受体拮抗剂ONO-1078和孟鲁司特、糖皮质激素地塞米松及中枢抗炎药米诺环素无明显作用.整体给予地塞米松(0.2,2,5 mg·kg-1)能减轻脑片对缺血损伤的程度;孟鲁司特仅大剂量给药(15 mg·k-1)有增强作用.结论离体小鼠脑片TTC产物formazan定量分析评价药物抗缺血性损伤作用的方法,可用于初筛具有直接神经保护作用药物.
关键词： 脑缺血 脑片 缺氧缺糖/再灌(OGD/RP) 2 3 5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 神经保护剂 -
促红细胞生成素对脑缺氧的保护作用
目的在细胞水平探讨促红细胞生成素(EPO)对缺氧诱发的神经元损伤的改善作用及缺糖缺氧诱发的脑片损伤的改善作用.方法采用原代新生大鼠皮层培养和小鼠脑片的方法,分别以形态学和二苯基四氮唑溴盐(MTT)及2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色为指标观察神经元及脑片的损伤和药物的改善作用.结果EPO在10-11,10-12mo1·L-1能显著改善缺氧24h引起的培养神经元死亡,其在10-9mol·L-1能改善缺氧45 min或缺糖缺氧15 min引起的脑片梗死.结论EPO对缺氧诱发的神经元死亡和缺糖缺氧诱发的脑片梗死具有保护作用.
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黄芩苷对小鼠脑片和大鼠皮质神经元缺氧缺糖/再灌注损伤的保护作用
目的 在离体水平,探讨黄芩苷对缺氧缺糖/再灌注(OGD/RP)诱导的脑片及神经元损伤的保护作用及机制.方法 小鼠离体脑片OGD/RP模型中,以2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)产物白(月无无白)评价脑片活性;原代培养大鼠皮层神经元OGD/RP模型中,以噻唑蓝(MTT)还原和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定神经元活性变化,用2,7-二氯荧光素二乙酸盐(DCF-DA)测定细胞内自由基水平.观察不同时间给予黄芩苷对损伤的保护作用.结果 在脑片,全程给药和OGD时给予黄芩苷0.01～1μmol·L-1,再灌注时给予黄芩苷0.1～1μmol·L-1,可显著减轻损伤.在神经元,全程给予黄芩苷0.1～1μmol·L-1可减轻神经元损伤,并降低神经元内自由基水平升高.结论 黄芩苷对OGD/RP损伤有浓度依赖性保护作用,再灌注时给药亦有效,其作用至少部分与抗自由基有关.
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不同培养基对海马脑片活性及微管相关蛋白tau表达的影响
目的探讨在不同培养基条件下,不同年龄大鼠的海马脑片在长期培养过程中的活性改变及微管相关蛋白tau表达的动态变化.方法制备1、2、4和8周龄雄性Wistar大鼠海马脑片(400μm),分别使用minimum essential medium(MEM)和Dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture(DMEM/F12)两种不同的培养基进行培养.在培养的21 d内以乳酸脱氢酶(LDH)法监测不同培养基条件下海马脑片活性的改变,并在不同时间点选取脑片以免疫印迹法检测tau蛋白含量的改变.结果在海马脑片的长期培养过程中,两种培养基对脑片活性的影响差异无显著性,而培养基DMEM/F12可使脑片中的tau蛋白更持久、更高量地稳定表达,尤其是2和4周龄鼠源海马器官型脑片.结论选取2或4周龄大鼠,应用培养基DMEM/F12更适合于脑片水平tau蛋白的相关研究,在此基础上可望建立阿尔茨海默病理想研究模型.
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苦参醇提取液镇静催眠作用的实验研究
苦参为豆科多年生落叶亚灌木植物苦参Sophora flavescens Ait.的根,性味苦寒,归心、肝、脾、肾、大肠、小肠诸经.具有清热燥湿除烦之功效.其主要有效成分为苦参碱、氧化苦参碱等,研究表明苦参碱有类似安定等作用[1].本实验采用抖笼换能器法、翻正反射法、海马脑片技术等观察苦参的镇静催眠作用,为扩大苦参的临床应用提供实验依据.
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在脑片水平上突触可塑性长时程增强的研究进展
长时程增强(LTP)是突触效能的重要表现形式,是研究学习与记忆突触机制的客观指标.近年来随着脑片技术的发展,很多关于LTP的实验研究都在脑片水平上进行.介绍了海马脑片CA1区LTP的调节表达机制的研究,海马脑片上诱导产生的LTP的特征和脑片条件的关系,多巴胺转运蛋白阻断剂通过活化D3多巴胺受体增强海马脑片CA1区LTP,以及激活大鼠海马脑片CA1区突触β-肾上腺素能受体增强联合LTP的研究,综述了在脑片水平上研究LTP的诱导表达维持及调节等方面的研究动态和进展.
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神经芯片:从神经元到脑研究的新技术
神经芯片技术是一种将神经元或脑组织与场效应晶体管技术结合起来研究神经元电活动和大脑学习记忆等高级功能的新技术.该技术具有无损伤检测及长时程记录的优点,是研究活体培育的神经元或神经元集群在不同外加刺激下的动力学过程的好方法,也是研究神经发育及神经损伤修复的强有力的工具.从其原理、结构、信号检测和脑片硅芯片技术等几个方面介绍神经芯片技术的新研究进展.
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一种可用于500μm脑片的高分辨率细胞内标记技术
目的:建立简便高效的、与脑片盲法膜片钳记录相结合的生物胞素细胞内标记染色方法.方法:制备大鼠听皮层脑片(500 μm),采用盲法脑片膜片钳全细胞记录,泳入生物胞素(0.2%)对记录细胞进行标记,经组织化学显色和甘油封片后,沿显微镜Z轴,每隔30 μm拍摄一帧显微数码图像,利用Adobc Photoshop软件对神经元进行三维重建.结果:标记的神经元层次清楚,可在光镜下分辨出胞体、轴树突分支、棘突等细微结构,而且非特异性背景染色浅;不需要进行厚脑片的二次切片即可对神经元进行三维重建.结论:本方法简便易行,结果可靠,分辨率高,而且对设备要求不高.
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丙泊酚及醒脑静预处理对大鼠离体脑片不同性质损伤的保护作用
目的：探讨丙泊酚和醒脑静注射液对大鼠离体脑片不同性质损伤的保护作用及其机制。方法取出生7 d的SD乳鼠脑皮质制备离体脑片，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色判断脑片活性后按随机数字表法分为正常对照组（A组）、谷氨酸（Glu）损伤组（B组）、过氧化氢（H2O2）损伤组（C组）、丙泊酚预处理Glu损伤组（D组）、醒脑静注射液预处理Glu损伤组（E组）、丙泊酚预处理H2O2损伤组（F组）、醒脑静预处理H2O2损伤组（G组）7组，每组12片。D、E、F、G组于培养3 d时进行药物预处理24 h（丙泊酚浓度为20 mg/L，醒脑静注射液浓度为10μg/mL）；脑片成功培养至4 d时用1 mmol/L Glu或0.1 mmol/L H2O2复制损伤模型，损伤后30 min所有组转入正常培养液中孵育至7 d。A组不予任何处理。观察脑组织及细胞形态学变化，尼氏体染色计数尼氏小体，碘化丙啶-吖啶橙（PI-AO）双染观察各组脑片细胞的红绿染色比例，流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果①脑片形态学观察：3d肉眼可见脑片轻度水肿，3～5d水肿逐渐消失，6d镜下可见大量典型的神经细胞及少量胶质细胞；7 d细胞生长达到顶点，之后凋亡逐渐占据主导。②苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态：A组神经元呈多边或梭形；B组及C组细胞数量较A组明显减少；D、E、F、G组神经元数量介于A组与B、C组之间，且组间存在差异。③尼氏体染色：A组尼氏小体清晰可见；B、C组染色后尼氏小体阳性细胞数较A组明显减少（个/HP：8.8±2.5、10.3±2.5比28.9±5.1，均P＜0.05）；D组、E组尼氏小体阳性细胞数较B组明显增多，且以D组增多更显著（21.5±4.7比13.4±3.1，P＜0.05）；F组、G组较C组明显增多，且以F组增加更显著（23.9±1.9比19.2±4.1，P＜0.05）。④PI-AO双染：A组细胞几乎全部呈现胞核绿色荧光；B组、C组大量神经元出现两种荧光，轮廊不清；D组、E组细胞胞质红染比例较B组有所减少，D组下降更为明显；F组、G组细胞胞质红染比例较C组有所减少，以F组更为明显。⑤细胞凋亡率：B组、C组凋亡率均较A组升高〔（22.00±0.64）%、（21.28±1.44）%比（8.57±0.67）%，P＜0.05〕；D组、E组细胞凋亡率较B组明显降低，且以D组降低更显著〔（11.94±0.57）%比（18.17±0.65）%，P＜0.05〕；F组、G组较C组明显降低，且以F组降低更显著〔（10.54±1.24）%比（13.12±0.13）%，P＜0.05〕。结论丙泊酚和醒脑静注射液对大鼠离体脑片的Glu和H2O2损伤均有保护作用，且对于同一种损伤，丙泊酚的脑保护作用较醒脑静注射液强。
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胶质细胞源性神经营养因子对运动神经元病培养模型的保护作用
目的 利用运动神经元病的脑片和脊髓片培养模型,观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对运动神经元的保护作用.方法 取1日龄SD乳鼠的大脑做脑片培养,取8日龄SD乳鼠脊髓做脊髓片培养.脑片在培养2周后,脊髓片在培养1周后,随机分为对照组、模型组(100 μmol/L THA)、不同浓度GDNF组(1 ng/ml、5 ng/ml和50 ng/ml),继续培养3周后,SMI-32免疫组化染色,分别计数脑片中皮层运动神经元和脊髓片中前角运动神经元数目的变化,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量.结果 模型组SMI-32阳性的皮层运动神经元数目和脊髓运动神经元数目较对照组明显减少,差异有显著性意义(P＜0.05),而GDNF各组神经元存活数目较模型组显著增多,差异有显著性意义(P＜0.05),脑片组和脊髓片组中的模型组LDH含量均对照组显著增高,差异有显著性意义(P＜0.05),GDNF各组培养液中LDH含量较对照组均升高,差异有显著性意义(P＜0.05).结论 GDNF能保护运动神经元免受谷氨酸兴奋毒性的损伤,使得GDNF在临床上治疗MND成为可能.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 运动神经元病 谷氨酸 脑片 脊髓片 -
青龙木提取物对大脑离体脑片自发放电的影响
目的 研究青龙木提取物(Amboyna preparation)对大鼠脑片缰核(habenular nucleus)和弓状核(arcuate nucleus)神经元自发放电的影响.方法 将大鼠丘脑制成薄片,记录到内侧缰核和弓状核神经元的自发放电,观察胰岛素和青龙木提取物对它们的影响.结果 对于内侧缰核神经元,青龙木提取物起兴奋作用,而胰岛素则起抑制作用.青龙木提取物对下丘脑弓状核神经元起兴奋作用.结论 缰核和弓状核可能参与青龙木提取物治疗糖尿病大鼠的作用.
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大鼠皮层及海马脑片体外培养影响因素的研究
目的 探讨大鼠皮层及海马脑片体外培养的影响因素和脑片培养的佳实验条件.方法 取大鼠离体皮层及海马脑片体外培养,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色检测细胞活力,观察不同的培养时间、培养液中葡萄糖浓度及培养温度对脑片活性的影响,以确定佳培养条件.结果 随着脑片孵育时间的延长,脑片活力逐渐衰减,表现为TTC染色A490 nm值下降.培养人工脑脊液中低糖含量及培养温度升高均会降低脑片活性.结论 选择(35±0.5)℃,含1.1 mmol/L葡萄糖浓度的人工脑脊液4 h以内可作为脑片佳体外培养条件.
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探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法
目的 探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法.方法 配制人工脑脊液以及切片所用的cutting液.将2 d大的幼鼠断头取脑,用振动切片机将脑切成脑组织切片,然后放入孵育槽内孵育备用.在孵育0.5～1 h后在显微镜下观察细胞的形态结构.结果 根据本方法操作,制得的脑组织切片细胞活性较高.结论 脑片可以满足膜片钳实验的需要.
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溴脱氧尿嘧啶核苷免疫荧光法标记海马脑片齿状回新增殖神经元的方法
由于溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)是DNA 成分胸腺嘧啶核苷类似物,故细胞可以摄取 BrdU 来代替胸腺嘧啶核苷,并复制新的 DNA 单链;同时,BrdU 的大分子特征使它具有抗原性.
