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幼犬脑组织Doublecortin的表达观测
目的 通过观测Doublecortin(微管相关蛋白)在幼犬脑的不同组织部位的表达,探讨哺乳动物出生早期的神经发育机制.方法 2016年7月-2017年4月,由长治医学院实验动物中心提供哺乳动物幼犬4只,出生后给予正常饲养15 d,后多聚甲醛灌注液灌注固定取脑,使用免疫组织化学方法观测Doublecortin在幼犬不同脑组织部位的表达情况,观测区包含:皮层、白质、海马、齿状回和室管膜下区.结果 Doublecortin在皮层、白质、海马、齿状回和室管膜下区均有丰富的表达分布,齿状回阳性细胞数:(29.70±2.14),室管膜下区阳性细胞数:(27.30±2.41),脑皮层阳性细胞数:(12.00±1.32),白质阳性细胞数:(18.50±1.88),海马阳性细胞数:(6.83±1.18),其中齿状回和室管膜下区表达较高,其中齿状回神经元的突起表达明显,伸展方向较为一致,室管膜下区表达密集,神经元突起成交错状态.在脑皮层第Ⅱ层有一层阳性表达,神经元突起方向与皮层呈垂直状态,皮层下各层均有表达,呈零星分布.结论 从实验可以看出哺乳动物家犬在出生后早期(15 d)脑组织内仍有大量的未成熟神经元存在,神经发育仍处于活跃状态.其中神经元生发区齿状回和室管膜下区神经发育为活跃,该两个区域在出生后仍然可以产生的新的未成熟的神经元,未成熟神经元在不断迁移的过程中逐渐发育成熟,终到达目的地;脑皮层Ⅱ层也可观测到有未成熟神经元存在,可能该区域也是神经生发区之一.
关键词： Doublecortin 脑皮层 齿状回 室管膜下区 -
丹栀逍遥散对广泛性焦虑大鼠海马齿状回神经干细胞增殖与分化能力的干预作用
目的 观察广泛性焦虑(generalized anxiety disease,GAD)大鼠海马齿状回区(Dentate Gyms,DG)5-溴脱氧尿核苷(Brdu)单标记和Brdu/神经元核抗体(Brdu/Neun)双标记阳性细胞的数量和中药丹栀逍遥散对其的干预作用.方法 将雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、中药组和西药组,每组10只.模型组、中药组、西药组采用不确定空瓶饮水刺激方法造成GAD大鼠模型.中药组和西药组分别以丹栀逍遥散和盐酸丁螺环酮水溶液灌胃7天,正常组和模型组以蒸馏水灌胃7天,每天1次.取脑组织,行冰冻切片,免疫荧光双标记法检测海马齿状回区Brdu单标记和Brdu/Neun双标记阳性细胞数量.结果 与正常组相比,模型组Brdu阳性细胞数明显增多(P＜0.01),但Brdu/Neun双标阳性细胞数减少(P＜0.05),差异均有统计学意义.与模型组相比,中药组Brdu阳性细胞数、Brdu/Neun双标阳性细胞数均明显增多,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).结论 GAD大鼠齿状回神经干细胞(NSCs)增殖较为活跃,但NSCs分化为成熟神经元的能力降低;丹栀逍遥散能够促进GAD大鼠DG区NSCs的增殖和向神经元的定向分化,增强机体的神经修复与再生能力,从而改善临床症状.
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不同刺激强度电针对正常大鼠大脑p-Akt表达的影响
目的:探讨相同穴位不同刺激强度电针的作用机理.方法:实验设对照组、中强度电针组、高强度电针组,分别电针"阳陵泉""足三里".中强度电针参数:2～4 mA、 20/4 Hz,高强度电针参数:5～7 mA、20/4 Hz,60 min后出针.隔日1次, 针刺3次后观察对正常鼠脑p-Akt表达的影响.采用免疫组化染色和SDS-PAGE电泳蛋白质分析技术观察p-Akt在海马CA1区、齿状回及皮质的表达. 结果:中强度电针组p-Akt在海马CA1区、齿状回及皮质的阳性细胞表达明显多于高强度电针及对照组, 统计学分析有显著性差异. 结论:不同强度的电针在促进p-Akt在海马CA1区、齿状回及皮质的表达中的作用不同.
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电针联合天麻多糖对脑缺血大鼠齿状回神经干细胞巢蛋白和干细胞因子表达的影响
目的:观察并比较电针联合天麻多糖与单独电针或天麻多糖治疗脑缺血大鼠对神经干细胞增殖的影响,探讨针药结合治疗脑缺血的机制.方法:将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、电针组、天麻多糖组和针药结合组,每组8只.以右侧大脑中动脉栓塞法制备脑缺血模型.造模后2周,天麻多糖组和针药结合组大鼠给予天麻多糖100 mg/kg灌胃,每天1次,连续2周;电针组和针药结合组大鼠给予“百会”、左侧“足三里”穴电针刺激,每次持续30 min,每天1次,连续2周.采用免疫组织化学染色法结合图像分析检测大鼠齿状回(DG)的内源性神经干细胞巢蛋白(Nestin)和干细胞因子(SCF)表达.结果:与正常对照组比较,模型组缺血侧DG的Nestin、SCF阳性表达增加(P＜0.05);与模型组比较,电针组、天麻多糖组和针药结合组缺血侧DG的Nestin、SCF阳性表达明显增加(P＜0.05);针药结合组阳性表达显著多于电针组或天麻多糖组(P＜0.05).结论:电针与天麻多糖结合可显著增加脑缺血大鼠缺血侧DG的Nestin、SCF表达,促进内源性神经干细胞增殖,且作用优于单用电针或天麻多糖.
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术中双壁定位椎弓根螺钉内固定治疗齿状突骨折
目的:探讨术中双壁定位寰枢椎椎弓根螺钉内固定治疗齿状突骨折的临床疗效.方法:自2006年6月至2010年9月采用双壁定位寰枢椎椎弓根螺钉固定治疗12例齿状突骨折,其中男8例,女4例,年龄18～62岁,平均37.9岁.按Anderson分类:Ⅱ型10例,Ⅲ型2例.新鲜骨折脱位9例,陈旧性骨折脱位3例.所有患者均有不同程度的颈枕部疼痛,颈部僵硬、活动受限.9例伴有脊髓损伤症状和体征,按美国脊髓损伤协会(ASIA)分级标准:C级4例,D级5例.术中经寰椎下壁、内壁,枢椎上壁、内壁定位后行寰枢椎椎弓根螺钉内固定治疗.结果:12例患者术中无椎动脉、脊髓及神经根损伤发生.术后随访6～24个月,平均14个月.X线和CT扫描显示所有寰枢椎椎弓根螺钉位置良好,植骨融合,无螺钉断裂、松动.所有患者枕颈部疼痛症状明显缓解.9例伴有神经损伤者按ASIA分级:C级1例,D级2例,E级6例.结论:术中双壁定位操作简单,寰枢椎椎弓根螺钉进钉点和进钉角度准确,可安全置入椎弓根镙钉并能获得满意的疗效.
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电针对帕金森病大鼠齿状回神经元型一氧化氮合酶表达和星形胶质细胞的影响
目的:观察帕金森病(PD)大鼠齿状回神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的改变,以及电针对它们的影响.方法:采用立体定位注射方法,将六羟基多巴胺注入SD大鼠右侧前脑内侧束.注射后第7天,根据大鼠阿朴吗啡腹腔注射所致的旋转行为筛选出12只PD模型,随机分为模型组(6只)和电针组(6只),另设正常组(6只).随后,电针组大鼠进行连续21d的电针处理,穴取“合谷”“太冲”,每日1次；其他组不做治疗干预.电针结束后采用免疫组织化学染色方法检测各组大鼠右侧齿状回nNOS和GFAP的表达.结果:①正常组大鼠右侧齿状回nNOS表达较弱,模型组的表达强度较正常组显著增高(P＜0.01).电针组的表达强度较模型组显著降低(P＜0.01),且与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05).②正常组大鼠齿状回多形细胞层有少量表达较弱的GFAP阳性细胞,模型组GFAP的表达强度较正常组显著增高(P＜0.01),而细胞数与正常组比较无显著性差异(P＞0.05).电针组GFAP的表达强度与模型组无显著性差异(P＞0.05),而细胞数较模型组显著增多(P＜0.01).结论:电针可逆转PD大鼠损伤侧齿状回nNOS的表达增高,并可促进其星形胶质细胞的活化.
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国人成年男性海马结构的冠状断层解剖学研究
目的:观察海马结构在脑的冠状断层切面上的形态及变化,为临床提供解剖学依据.方法:采用14例经10%福尔马林固定的成年男性脑标本,制作垂直于连合间线(AC-PC间线)层厚4mm的冠状切面,对其前表面逐层照相;在典型切片的前表面上对海马结构进行观察测量.结果:从前往后,海马结构在第16～18冠状断层切面上出现,第24～26层面消失,其典型层面为7个,并获得了各层面海马结构的逐项解剖学参数.结论:在脑的不同冠状断层切面上海马结构有一系列的位置及形态变化,海马从前往后逐渐变小,齿状回则相反;海马从前往后由较宽变成略圆,其冠状面上的长轴先略向内上,再略向内下,然后又逐渐向内上至45°左右.
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氯化锂促进不同年龄成年小鼠齿状回细胞增殖与神经发生
目的观察氯化锂(LiCl)对不同年龄成年小鼠齿状回细胞增殖与神经发生的影响.方法以氯化锂喂养动物,用5-溴-2′-脱氧尿核苷(BrdU)标记新生细胞,免疫组织化学染色后统计新生细胞数量;应用BrdU与TuJI/GFAP双标记,鉴别出BrdU阳性细胞的细胞类型.结果不同年龄成年小鼠齿状回的BrdU阳性细胞形态无明显差别,48周龄组阳性细胞的数量明显低于8周龄组;LiCl组小鼠新增殖细胞明显多于对照组,其中约有70%为神经元,4%～5%左右为神经胶质细胞.结论服用LiCl可显著增强成年小鼠齿状回的细胞增殖与神经发生,部分逆转其随年龄增长而逐渐减低的趋势,对于中枢神经系统退行性疾病的预防与治疗可能有重要的意义.
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怀孕可增加小鼠海马齿状回的细胞增殖和神经发生
目的观察怀孕对小鼠海马齿状回(DG)和脑室下层(SVZ)的细胞增殖和神经发生的影响.方法5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记新生细胞结合免疫组织化学方法对脑切片进行BrdU、TuJ1及GFAP单标或双标染色.结果怀孕小鼠齿状回的细胞增殖和神经发生明显高于正常未孕成年雌性小鼠,脑室下层中细胞增殖的数目在两者却无明显差异.在齿状回新生的细胞中大约有80%为新生的神经元,3%～5%为神经胶质细胞. 结论成年小鼠海马齿状回的细胞增殖和神经发生可能因怀孕而显著增多,这些新生的细胞对海马的功能可能有重要的影响.
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一个在小鼠头部特异表达的新基因BSG1 cDNA的克隆及研究
目的克隆小鼠头部发育过程中特异表达的新基因并对新基因可能的功能进行初步分析. 方法采用消减差异筛选的方法筛选小鼠头部特异表达的新基因,并用生物信息学的方法对克隆到的新基因进行序列分析和蛋白结构域的预测.同时,还采用了小鼠胚胎原位杂交、小鼠脑部切片的原位杂交以及鸡胚的原位杂交方法研究BS61基因的表达情况. 结果克隆到1个与小鼠头部发育相关的新基因BSG1(brain specific gene 1),其Gen Bank的登录号为AY210402.该基因包含1个2133bp的完整阅读编码框,编码1个710aa的C2H2型锌指蛋白.它与人的KIAA0441基因在氨基酸水平上有82.8%的同源性.该基因定位在小鼠的第10号染色体上,含7个外显子,6个内含子.BSG1主要在小鼠胚胎、鸡胚的头部表达,并且BSG1在小鼠头部表达的部位局限在海马、齿状回和小脑. 结论 BSG1是1个可能的转录因子,在脑部特异表达.对其研究有助于进一步揭示大脑发育的分子机理.
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大鼠创伤性脑损伤后海马齿状回中脑脂结合蛋白的表达变化
目的 观察大鼠创伤性脑损伤(TBI)后不同时间点海马结构齿状回中脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化.方法 将72只SD大鼠随机分为脑损伤组、假手术组和空白对照组,制备大鼠颅脑液压损伤模型,伤后1、3、7、14d分别行海马组织Western blotting和BLBP、波形蛋白(Vimentin)免疫荧光双标检测.结果 Western blotting结果显示,伤后1d BLBP蛋白含量相对于空白对照组下降(P＜0.01),后逐渐上升,至伤后7d BLBP蛋白含量与其他各组比较达到高峰(P＜0.01),伤后14d又下降低于空白对照组水平(P＜0.01).BLBP和Vimentin双标阳性细胞数量变化趋势基本与Western blotting结果相一致.损伤侧海马BLBP和Vimentin双标阳性细胞主要分布于海马齿状回颗粒下层,多数呈放射状胶质细胞(RGCs)形态; 伤后7d,齿状回门区也出现BLBP和Vimentin双标阳性细胞,大多为反应性星形胶质细胞形态.结论 大鼠创伤性脑损伤后,损伤侧海马齿状回中BLBP的表达呈现先下降后上升,至伤后7d达到高峰,后又急剧下降的规律,BLBP的表达变化可能与海马神经再生和神经功能恢复有关.
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死亡受体5在小鼠神经增殖细胞中的表达
目的 探讨死亡受体5(DR5)对神经细胞增殖的影响.方法 采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、DR5、Doublecortin(DCX)等抗体免疫荧光标记法,检测各发育阶段(从胚胎期至生后成年,共100只小鼠)脑组织内DR5阳性细胞的表达变化,以及DR5阳性细胞与神经增殖细胞的关系.]结果在胚胎期和新生鼠中,DR5阳性细胞密集分布于海马齿状回颗粒细胞层,呈强表达.7日龄(P7)后,DR5阳性细胞减少,强表达的阳性细胞密集分布在齿状回的下颗粒层,其余颗粒细胞呈弱表达.P30后,在齿状回的下颗粒层仅发现少数DR5阳性细胞,其余颗粒细胞不表达ＤＲ5.同时,在其他神经细胞增殖区,如新生鼠(P0)小脑外颗粒区和P7嗅球的喙侧迁移流(RMS)区域,DR5阳性细胞的表达和分布规律均表明,DR5阳性细胞是增殖的神经细胞或有丝分裂后期的新生神经元.进一步的实验发现,齿状回下颗粒层的DR5阳性细胞与BrdU阳性细胞或Doublecortin阳性细胞共存,表明DR5阳性细胞是神经前体细胞和新生神经元.结论 DR5阳性细胞是增殖的神经细胞和新生神经元,提示DR5参与神经细胞增殖与分化.
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血管性痴呆大鼠海马齿状回神经前体细胞增殖的动态变化及养血清脑颗粒的影响
目的：观察血管性痴呆(VD)大鼠海马齿状回(DG)神经前体细胞(NPCs)增殖的动态变化及养血清脑颗粒的影响。方法72只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=24)、VD模型组(模型组, n=24)和养血清脑颗粒治疗组(治疗组, n=24)，采用改良的Pulsinelli四血管阻断法制作VD大鼠模型。分别在造模术后1、2、4和8周采用Western blotting法检测Nestin的表达水平，用免疫荧光法观察海马齿状回区5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)和BrdU/Nestin的表达。结果模型组和治疗组各时间点大鼠Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表达持续增多，4周时达高峰。与假手术组比较，模型组各时间点Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表达明显增多(P<0.01)；与模型组比较，治疗组各时间点Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表达明显增多(P<0.01)。结论养血清脑颗粒可促进VD大鼠海马齿状回区NPCs增殖。
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脑缺血后神经发生与血管生成的联系与作用
近年来,以神经干细胞(neural stem cells,NSC)为方向的研究以促进神经再生为治疗靶点,逐渐成为神经科学研究的热点之一.成年中枢神经系统中存在NSC的主要脑区是侧脑室外侧壁的室下带(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranuhr zone,SGZ).NSC在一定条件下可增殖分化成神经元和胶质细胞,参与神经功能的修复过程,称为神经发生(neurogenesis).
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内源性神经干细胞与脑缺血后干细胞治疗
脑血管疾病是当今人类死亡原因之一，其中缺血性脑血管病的发病率约占全部脑血管病的80％左右［1］。脑血管病因其发病率、致残率及死亡率之高而成为严重的社会问题。因此如何预防和早期开展积极有效的治疗，降低缺血性脑血管病的死亡率、致残率、提高患者生活质量，成为当前一项艰巨的任务。研究发现，在人类及其他成年的哺乳动物脑内海马齿状回及室管膜下区等部位广泛存在神经干细胞［2-3］。神经干细胞在生理状态下长期存在，具有自我更新和多向分化潜能。在脑组织损伤后，海马齿状回及室管膜下区区域的神经干细胞即会出现增殖、向损伤区域迁徙并且分化为成熟神经细胞，终修复损伤部位［4-5］。尽管脑缺血损伤可以促进内源性神经干细胞的增生，但缺血对神经干细胞的刺激有限，细胞的再生能力不足以满足临床需要。近年来随着对干细胞研究的深入，应用外源性神经干细胞移植治疗脑损伤的尝试取得了较大的进展，但因细胞移植治疗面临伦理的拷问、干细胞资源匮乏以及移植后的免疫排斥反应等问题而受到诸多限制。因此，如何大程度地激发内源性神经干细胞的增生、分化，是促进脑缺血后神经功能恢复的有效途径。
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不同程度慢性间歇低氧对大鼠齿状回Nogo-A和NgR表达的影响
目的 观察不同程度慢性间歇性低氧对大鼠齿状回神经细胞Nogo-A和NgR的影响及意义.方法 将成年雄性Wistar大鼠45只,随机分为对照组、5％间歇低氧组、10％间歇低氧组,每组15只.又按时间分为7、14和28d3个时间点,每个时间点5只.5％间歇低氧组和10％间歇低氧组分别暴露于间歇性低氧条件下(暴露时间8 h/d).HE染色观察齿状回神经细胞形态变化,应用免疫组织化学法检测Nogo-A和NgR的表达水平.结果 与对照组比较,5％间歇低氧组和10％间歇低氧组齿状回神经元结构受损,神经元密度明显减少(18.45±3.05,22.36±2.96 vs 28.96±4.12,P＜0.05),于28 d达高峰,且以5％间歇低氧组更显著(P＜0.05);各时间点Nogo-A和NgR蛋白表达均增加(P＜0.05),于28 d达高峰,以5％间歇低氧组更显著(P＜0.05).结论 不同程度慢性间歇性低氧可以引起大鼠齿状回Nogo-A和NgR表达水平增加,神经元结构受损和密度减少,可能与其抑制神经纤维修复有关.
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脑缺血后大鼠血管内皮生长因子与神经发生的形态学研究
目的 现察缺血性脑损伤后大鼠海马内源性血管内皮生长因子(VEGF)表达与海马齿状回神经发生的相关性.方法 将24只雄性SD大鼠随机分为脑缺血组[2]只)和假手术组(3只),脑缺血组大鼠通过改良的4血管闭塞法建立缺血性脑损伤模型,于6、12、24 h和3、6、12和24天,用免疫组织化学及荧光双标记染色法观察不同时间点大鼠海马内源性VEGF表达及神经发生水平.结果 脑缺血组大鼠海马区内源性VEGF表达主要集中于海马齿状回和门区,亚颗粒增生带可见丛集VEGF表达阳性细胞;海马齿状回神经发生水平于缺血后第3天时较假手术组升高,于6天时达到峰值(P<0.01).缺血后早期海马VEGF表达多见于神经元细胞质,在缺血后期则主要见于胶质细胞质.结论 大鼠脑缺血后,来源于海马齿状回神经元的VEGF表达可能是缺血诱导的齿状回神经发生水平上调的一个重要始动信号,胶质细胞表达的内源性VEGF表达可能参与了齿状回神经发生的后续过程.
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离子型谷氨酸受体拮抗剂对大鼠脑缺血再灌注后海马齿状回5-溴脱氧尿核苷表达的影响
目的观察选择性离子型谷氨酸受体(iGluRs)拮抗剂对大鼠全脑缺血再灌注损伤后齿状回神经发生的调控作用,探讨谷氨酸-离子型谷氨酸受体通路在神经发生中的作用.方法采用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记分裂细胞,比较大鼠全脑缺血再灌注损伤后7 d和14 d时各iGluRs拮抗剂处理组与相应对照组之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度.结果腹腔注射N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体阻滞剂5-甲基二氢二苯丙环庚烯亚胺后显著抑制了大鼠全脑缺血后7 d和14 d时齿状回神经发生水平的升高,BrdU免疫阳性细胞数较缺血再灌注+生理盐水组各时间点明显减少;而α-氨基羟甲基恶唑丙酸和(或)红藻氨酸受体阻滞剂二硝基喹喔啉对全脑缺血后不同时间点齿状回神经发生的增强基本没有影响.结论全脑缺血再灌注损伤后NMDA受体通路的激活可能促进了齿状回神经发生.
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病毒载体介导血管内皮生长因子基因表达对大鼠脑缺血后齿状回神经发生的影响
目的 观察重组腺相关病毒(rAAV)载体介导人源血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转移表达对成年大鼠缺血性脑损伤后,海马齿状回神经前体细胞增殖水平的影响.方法 SD大鼠27只.随机分为rAAV2组(18只)和对照组(9只),将携带hVEGF165基因的rAAV颗粒立体定向给药至rAAV2组大鼠右侧海马2周后,全部大鼠采用4血管闭塞方法建立大鼠缺血性脑损伤模型,于缺血后6、24和48天时,各组随机选取1/3的大鼠处死,分别应用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测大鼠海马hVEGF165 mRNA的表达水平或齿状回神经前体细胞的增殖水平.结果 荧光显微镜下观察,rAAV2组大鼠海马齿状回均可见报告基因增强型绿色荧光蛋白的表达;rAAV2组大鼠缺血后6、24和48天时,均有海马hVEGF165 mRNA表达,3个时间点比较无统计学差异(P>0.05);rAAV2组大鼠缺血后6、24和48天时.齿状回神经前体细胞增殖水平较对照组显著增高(P<0.05).结论 rAAV载体可介导目的 基因hVEGF165高效转染海马神经元,并促进缺血诱导的齿状回神经前体细胞增殖.
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成年哺乳动物海马齿状回神经发生的研究进展
神经发生指神经干细胞增殖、存活和分化的过程,传统的观点认为成年哺乳动物中枢神经系统不存在神经发生.近年大量研究证实成年哺乳动物海马齿状回终身存在着神经发生,这为脑损伤和神经系统变性疾病如老年性痴呆的治疗带来希望,通过刺激机体自身的神经发生使中枢神经系统实现自我修复,有望为神经系统疾病的治疗开拓新领域.
