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死亡受体5在小鼠神经增殖细胞中的表达
目的 探讨死亡受体5(DR5)对神经细胞增殖的影响.方法 采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、DR5、Doublecortin(DCX)等抗体免疫荧光标记法,检测各发育阶段(从胚胎期至生后成年,共100只小鼠)脑组织内DR5阳性细胞的表达变化,以及DR5阳性细胞与神经增殖细胞的关系.]结果在胚胎期和新生鼠中,DR5阳性细胞密集分布于海马齿状回颗粒细胞层,呈强表达.7日龄(P7)后,DR5阳性细胞减少,强表达的阳性细胞密集分布在齿状回的下颗粒层,其余颗粒细胞呈弱表达.P30后,在齿状回的下颗粒层仅发现少数DR5阳性细胞,其余颗粒细胞不表达ＤＲ5.同时,在其他神经细胞增殖区,如新生鼠(P0)小脑外颗粒区和P7嗅球的喙侧迁移流(RMS)区域,DR5阳性细胞的表达和分布规律均表明,DR5阳性细胞是增殖的神经细胞或有丝分裂后期的新生神经元.进一步的实验发现,齿状回下颗粒层的DR5阳性细胞与BrdU阳性细胞或Doublecortin阳性细胞共存,表明DR5阳性细胞是神经前体细胞和新生神经元.结论 DR5阳性细胞是增殖的神经细胞和新生神经元,提示DR5参与神经细胞增殖与分化.
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诱导细胞凋亡的抗hDR5单抗的研究
目的研制能诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5单克隆抗体(McAb).方法以可溶性人死亡受体(death receptor,DR)5胞外段免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人DR5的McAb;MTT方法筛选分泌有细胞毒活性McAb的杂交瘤细胞;亲和层析方法纯化McAb;夹心ELISA法测定McAb亚型;Western blot和斑点ELISA法检测McAb的抗原表位类型;间接ELISA法检测McAb的特异性;流式细胞仪检测FITC-annexinV/PI双色标记的Jurkat细胞的凋亡率;DNA琼脂糖凝胶电泳测定凋亡细胞的DNA片段化.结果获得1株杂交瘤细胞,其分泌的McAb命名为mDRA-6,为IgG1;其抗原表位类型为构象表位;其特异性识别hDR5,与hFas、hDR4等无交叉反应.mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用;经McAb mDRA-6处理后,Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂,并导致Jurkat细胞中的DNA片段化.结论mDRA-6是一个具有诱导细胞凋亡活性的新的抗人DR5功能性抗体,在以TRAIL/DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景.
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TRAIL及其受体DR4/DR5在急性肾脏移植排斥反应中作用的探讨
目的探讨新型肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL及共受体DcR4/DcR5在急性肾脏移植排斥反应作用.方法利用流式细胞术对正常人及发生急性肾脏移杆排斥患者外周血单个细胞(PBMC)表面的TRAIL分布进行探讨;用免疫组织化学的方法对正常人肾脏和急性排斥坏死肾脏病理切片DR4和DR5进行分析.结果正常人PBMC几乎不表达TRAIL,急性肾脏热电厂斥患者PBMC高表达TRAIL,进一步证实其为IFN-γ+细胞表达;正常人肾脏表达的DR4和DR5低,但急性肾排患者高表达DR4和DR5.结论TRAIL及其受体DR4/DR5之间的作用可能参与了肾脏急性排斥反应.
关键词： 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 死亡受体4 死亡受体5 肾脏移植 移植排斥 -
hCTB006联合伊立替康对胃癌细胞BGC823、SGC7901协同杀伤的作用机制
目的:研究人死亡受体(death receptor5,DR5)激动型抗体hCTB006联合伊立替康对不同分化程度胃癌细胞BGC823、SGC7901的体外抑瘤作用,并对其诱导胃癌细胞凋亡的机制进行初步探讨.方法:实验将BGC823、SGC7901细胞分为伊立替康组、hCTB006组和两者联合应用组,应用ATPlite法研究各组药物的体外抑瘤作用；采用ELISA法研究伊立替康处理胃癌细胞前后DR5表达的变化,采用Western blot技术检测药物处理前后BGC823、SGC7901细胞X-联锁凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitory of apoptosis protein,XIAP)的表达变化情况.结果:BGC823对hCTB006中度敏感,对SGC7901不敏感,伊立替康对胃癌细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性,与hCTB006联合用药后对BGC823具有良好的协同抑制作用,但对SGC7901协同作用不明显.ELISA测得伊立替康处理后胃癌细胞DR5的表达量无明显变化.但伊立替康和hCTB006联合用药可使胃癌细胞BGC823内XIAP水平明显降低,而对SGC7901细胞内XIAP没有明显作用.结论:伊立替康联合hCTB006后对低分化胃癌细胞BGC823的增殖有明显协同抑制作用,而对中度分化的SGC7901细胞呈拮抗作用,这种诱导胃癌细胞凋亡的机制可能与其DR5的表达无关,而与联合作用后细胞抑凋亡蛋白XIAP的表达水平有关.
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肿瘤细胞对TRAIL敏感性与其表面DR5表达水平的相关性研究
目的探讨肿瘤细胞表面DR5表达水平与其对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)敏感性之间的关系.方法利用抗DR5特异性单克隆抗体,采用流式细胞仪技术直接检测不同肿瘤细胞系表面DR5的表达水平,并采用TRAIL凋亡检测试剂盒检测肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,研究两者之间的关系.结果不同肿瘤细胞表面DR5的表达水平分别为:U937细胞 97.9%、Jurkat细胞 95.1%、SW480细胞 93.8%、HCT116 细胞86.2%、HL-60细胞 64.2%、HeLa细胞 46.6%、K562 细胞13.1%;TRAIL诱导的细胞凋亡率分别为:U937细胞 72.6%、Jurkat细胞 85.2%、SW480细胞 78.6%、HCT116细胞 70.2%、HL-60细胞 60.1%、HeLa细胞 45.4%、K562 细胞12.3%.经统计学分析,两者之间呈现非常明显的正相关(r=0.997, P<0.001).结论肿瘤细胞对TRAIL的敏感性与其表面DR5表达水平有关,表明DR5的表达水平在TRAIL诱导细胞凋亡方面起着十分重要的作用.
关键词： 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 死亡受体5 细胞凋亡 -
死亡受体5与肝癌细胞凋亡的相关性
目的探讨人死亡受体5(DR5)及其配体(TRAIL)和竞争性单克隆抗体(DR5mAb)对肝癌细胞凋亡的影响.方法采用半定量RT-PCR及Western blot法检测肝癌细胞株HepG2、SMMC7721和正常人肝细胞株LO2的DR5在mRNA和蛋白水平的表达含量.应用四甲基偶氮唑盐法测试细胞的生长曲线,以观察TRAIL和DR5mAb对肝癌细胞生长的抑制作用,并用流式细胞仪测定细胞的凋亡率.结果肝癌细胞株HepG2、SMMC7721的DR5高表达,正常人肝细胞株LO2的DR5低表达,差异有统计学意义(P＜0.05).肝癌细胞的增殖率随着TRAIL浓度的增加而逐渐降低,但当TRAIL超过1000 ng/ml时,肝癌细胞株的增殖率就不再下降;而肝癌细胞的增殖率随着DR5mAb浓度的增加而逐渐降低,呈现明显的剂量依赖关系.1000 ng/ml TRAIL处理24 h时,HepG2的凋亡率在14.74%±0.48%,继续增加TRAIL浓度,其凋亡率无显著改变;而同样剂量的DR5mAb处理24 h时,HepG2的凋亡率高达52.45%±0.57%,明显高于前者(P＜0.05).同时发现,正常人肝细胞株LO2的增殖率随着TRAIL浓度的增加呈下降趋势,与PBS阴性对照组差异有统计学意义(P＜0.05);而DR5mAb的浓度变化对人正常肝细胞株LO2无明显影响.结论死亡受体DR5在诱导肝癌细胞凋亡中起重要的作用;DR5mAb选择性地诱导肝癌细胞凋亡,对人正常肝细胞无诱导凋亡作用.
关键词： 死亡受体5 单克隆抗体DR5mAb 肝肿瘤 细胞凋亡 -
氯喹上调死亡受体5表达增强Huh7细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性
目的 探讨氯喹对肝细胞癌Huh7细胞死亡受体5(DR5)表达及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的细胞增殖和凋亡的影响.方法 Huh7细胞分为对照组(1∶1000二甲基亚砜)、TRAIL组(50μg/L)、氯喹组(10μmol/L)及TRAIL+氯喹组(TRAIL 50 μg/L+氯喹10 μmol/L),四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的增殖活性;免疫荧光检测各组细胞DR5蛋白的表达情况;4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色观察细胞凋亡,并用蛋白质印迹法检测细胞凋亡指标切割的聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(cleaved PARP)的表达情况.结果 TRAIL处理可降低Huh7细胞增殖活性,以对照组细胞活力为对照时,氯喹组、TRAIL组及TRAIL+氯喹组细胞增殖抑制率分别为(89±8)％、(53±10)％及(27±7)％;与TRAIL组相比,TRAIL+氯喹组细胞增殖活力下降(t=3.922,P=0.017).氯喹组上调细胞DR5的表达,TRAIL+氯喹组可活化细胞凋亡信号,TRAIL组和TRAIL+氯喹组细胞的凋亡率分别为(10.0±2.3)％和(20.4±4.0)％,两组比较差异有统计学意义(t=3.894,P=0.018).结论 氯喹可通过上调Huh7细胞DR5的表达,增强细胞对TRAIL作用的敏感性.
关键词： 癌 肝细胞 氯喹 死亡受体5 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 -
DR5在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗表达分布及年龄相关性变化
目的研究GJB2基因条件敲除（cCx26Pax2Cre）小鼠耳蜗DR5表达情况，探讨GJB2基因突变导致耳聋的机制。方法 cCx26Pax2Cre小鼠为实验组，BALB/C小鼠为对照组，分别取P8、P12和P21时小鼠耳蜗行冰冻切片，利用荧光标记免疫组织化学方法和激光共聚焦显微镜技术观察死亡受体5（death receptor，DR5）蛋白在耳蜗的表达情况，用Image Pro Plus 6.0计算平均光密度值，SPSS 18.0进行统计分析。结果 P8时DR5主要表达在柯蒂氏器外侧的支持细胞、耳蜗外侧壁Ⅱ型纤维细胞、盖膜，随着日龄的增加，表达逐渐向内侧延伸到内侧支持细胞，P12和P21时还出现了螺旋缘、毛细胞、螺旋神经节细胞、螺旋凸DR5表达阳性，而且表达强度随日龄增加而逐渐变强。在野生小鼠DR5也有表达但较弱。与野生型小鼠相比， cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗蜗轴螺旋管内神经纤维DR5表达的光密度值明显增大，经统计学分析两者具有显著性差异（P<0.05）。结论 cCx26Pax2Cre小鼠缝隙连接功能异常，可能导致耳蜗细胞出现葡萄糖短缺，导致三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate， ATP)不足，引起DR5的表达上调，直接激活凋亡的死亡受体途径，或间接激活线粒体通路使凋亡信号进一步放大，导致耳蜗细胞凋亡的发生，终引起cCx26Pax2Cre小鼠听力下降。
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维生素E琥珀酸酯增强DR5抗体对Raji和K562细胞的凋亡作用
目的:探讨VES增强抗DR5单抗mDRA-6诱导白血病细胞凋亡作用及可能机制.方法:MTT法检测VES及mDRA-6对白血病细胞Raji和K562细胞的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染分析白血病细胞凋亡;流式细胞术检测细胞表面DR5表达;免疫印迹技术检测细胞DR5蛋白表达.结果:MTT检测表明,浓度为10 μg/mL的mDRA-6作用12 h,Raji及K562细胞死亡率分别为21.98%和5.23%,而5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的VES分别与mDRA-6共同作用于Raji或K562细胞,Raji细胞死亡率分别增加至24.67%(P>0.05)、35.65%(P<0.01)和40.22%(P<0.01),K562细胞死亡率分别增加至6.00%(P>0.05)、7.89%(P<0.01)、8.67%(P<0.01).AnnexinⅤ/PI 双染检测2 μg/mL 的mDRA-6 单独作用Raji 及K562 细胞12 h,细胞凋亡率分别为20.79%和7.74%,2 μg/mL的mDRA-6与10 μmol/L的VES共同作用Raji及K562细胞12 h,细胞凋亡率分别增至43.18%和16.99%.Raji和K562细胞表面DR5自然表达分别为42.35%和14.92%;10 μmol/L的VES作用Raji、K562细胞12 h后,细胞膜DR5表达率分别增加至70.08%和16.38%.免疫印迹技术检测显示,不同浓度的VES均可增加Raji和K562细胞DR5蛋白表达.结论:VES增强mDRA-6对白血病细胞系Raji和K562细胞的凋亡诱导作用,可能是VES增加了Raji和K652细胞膜DR5表达及细胞DR5蛋白表达所致.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 死亡受体5 单克隆抗体 凋亡 维生素E琥珀酸酯 -
死亡受体5在肝癌细胞系及肝细胞系表面的表达
目的:利用抗死亡受体5(Death Receptor 5)单克隆抗体(mAb),检测DR5在肝癌细胞系的表达.方法:sDR5免疫BALB/c小鼠,小鼠脾细胞与SP2/0-Ag 14细胞在50%PEG条件下融合,获得能够分泌抗DR5单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用杂交瘤细胞株分泌的抗DR5特异性单克隆抗体,采用流式细胞仪技术测定抗DR5 mAb结合至细胞表面的量来分析死亡受体DR5在肝癌细胞系及肝细胞表面的表达情况.结果:不同细胞表面DR5的表达水平分别为:人肝癌SMMC7721细胞95%、人肝细胞癌HepG2细胞40%,人正常肝细胞HL-7702 20.3%.结论:抗DR5 mAb能够特异性与DR5结合.DR5在人肝癌SMMC7721细胞高水平表达,人肝细胞癌HepG2细胞中度表达,人正常肝细胞HL-7702细胞低表达.该特异性mAb在研究TRAIL受体的生物功能上是一种有用的工具,对研究DR5在组织和细胞系表达十分有价值.
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人DR5胞外区域克隆及在大肠埃希菌中表达
目的 克隆人死亡受体5(DR5)cDNA的胞外区域(eDR5),构建原核重组表达载体pGEX-eDR5,使eDR5在大肠埃希菌中表达.方法 采用RT-PCR(反转录PCR)方法从人肝癌细胞HepG2中获得eDR5,然后克隆到pMD19.T载体上进行测序,得到正确的基因片段.经双酶切将目的 基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,测序正确后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达GST-eDR5融合蛋白,后用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的 蛋白的表达量.结果 重组克隆载体pMD-eDR5经测序鉴定序列正确.构建的融合表达载体pGEX-eDR5在大肠埃希菌中表达,可溶性目的 蛋白占细菌总蛋白约19%.结论 成功克隆了人DR5 cDNA的胞外区域,并在大肠埃希菌中表达.为下一步分离纯化人DR5重组蛋白,制作多克隆抗体提供基础依据.
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肝细胞生长因子在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下对原代肝星状细胞增殖及凋亡的影响
背景:活化的肝星状细胞是肝纤维化的关键因素,研究表明肝细胞生长因子能促进星状细胞凋亡,其具体机制可能与增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导星状细胞凋亡有关.目的:观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下,肝细胞生长因子对原代肝星状细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其可能机制.方法:将SD 大鼠原代肝星状细胞复苏、传代,细胞增殖明显时用于实验.实验分为4 组:空白对照组为单纯肝星状细胞培养;肝细胞生长因子组:将100 μg/L 肝细胞生长因子作用于肝星状细胞;TRAIL 组:将2 mg/L 的TRAIL 作用于肝星状细胞;肝细胞生长因子+TRAIL 组:将肝细胞生长因子预先刺激肝星状细胞24 h,再加入2 mg/L TRAIL.结果与结论:MTT 检测显示肝细胞生长因子及TRAIL 分别在50~200 μg/L、0.5~1.5 mg/L 各浓度下对肝星状细胞增殖抑制率无影响,TRAIL 在2 mg/L 作用下对肝星状细胞有抑制作用.流式细胞仪检测肝细胞生长因子+TRAIL 组的中晚期凋亡率明显高于空白对照组及肝细胞生长因子组(P < 0.05);肝细胞生长因子+TRAIL组DR5荧光强度明显高于其他3组(P < 0.01).提示在TRAIL 作用下,肝细胞生长因子能促进肝星状细胞的凋亡、抑制其增殖.可能与肝细胞生长因子上调活化肝星状细胞表面DR5 表达有关.
关键词： 肝星状细胞 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 肝细胞生长因子 凋亡 死亡受体5 -
骨髓间充质干细胞体外调控肝星状细胞死亡受体5的表达
背景:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可以通过上调死亡受体5 蛋白的表达诱导大鼠肝星状细胞凋亡.目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞死亡受体5 和Caspase-3 蛋白表达的影响,探讨骨髓间充质干细胞诱导肝星状细胞凋亡及其机制.方法:贴壁筛选法培养、纯化SD 大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3 代使用;大鼠原代肝星状细胞和肝纤维原细胞系冻融后传代使用.应用6 孔培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养.将细胞分为4 组:①空白对照组:肝星状细胞和骨髓间充质干细胞分别单独培养.②阴性对照组:肝纤维原细胞与肝星状细胞共培养(模拟星状细胞体内生长环境).③骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养组.④实验组:1.5 mg/L TRAIL 多克隆抗体与骨髓间充质干细胞作用6 h 后,不换液,再与肝星状细胞共培养.结果与结论:在共培养组中肝星状细胞的增殖降低,凋亡增加,且肝星状细胞死亡受体5、Caspase-3 蛋白的表达均显著升高,并呈时间依赖性,且与其他组比较差异有显著性意义(P < 0.01).实验组Caspase-3 和死亡受体5 蛋白的表达在共培养的各个时间段均低于共培养组,与共培养组比较差异有显著性意义(P < 0.01).提示骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养能抑制肝星状细胞的增殖,促进肝星状细胞的凋亡,其机制可能为骨髓间充质干细胞旁分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体通过上调Caspase-3 和死亡受体5 蛋白的表达实现的.
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TRAIL及其受体DR5在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中的表达和意义
目的 研究肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)及其死亡受体5(DR5)在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中病变不同时期的表达及与细胞凋亡的关系.方法 建立病毒性心肌炎小鼠模型,于注射病毒后第7、10、14、21、28天取心肌组织,HE染色做心肌病理积分,TUNEL法检测凋亡细胞百分率,免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织中TRAIL和DR5蛋白及mRNA的表达.结果 病毒感染组小鼠和正常对照组小鼠心肌组织中均存在TRAIL和DR5蛋白和mRNA的表达.病毒感染后第14天,病毒感染组小鼠心肌组织中TRAIL蛋白表达高于同期正常对照组(P<0.05)和第7天病毒感染组(P<0.05),组间比较差异有统计学意义(F=9.17,P<0.01).病毒感染后第10、14、21天,病毒感染组小鼠DR5蛋白表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=13.32,P<0.01).且TRAIL和DR5蛋白的表达与心肌病理积分、心肌细胞凋亡率密切相关(P<0.05).病毒感染组第10天TRAIL mRNA表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=10.86,P<0.01).病毒感染组第10、14天DR5 mRNA表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=22.75,P<0.01).结论 病毒性心肌炎小鼠发病中期,TRAIL及其受体DR5在心肌组织中出现高表达,且与病理积分、心肌细胞凋亡率成正相关,TRAIL及其受体DR5可能通过调控心肌细胞凋亡参与病毒性心肌炎的病理过程.
关键词： 柯萨奇病毒 心肌炎 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 死亡受体5 细胞凋亡 -
抗人DR5单克隆抗体诱导Jurkat和U937细胞凋亡的线粒体信号通路
目的:探讨抗人死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡的线粒体信号通路.方法:MTT 法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞生长增殖的影响,以及caspase-9、3抑制剂对mDRA-6抑制Jurkat和U937细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat和U937细胞DNA片段化降解;Western blot 检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞bax、bcl-2、bcl-xl、Cyt c及caspase-9、3的激活改变.结果:mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制Jurkat和U937细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用6、8和10小时,Jurkat细胞增殖抑制率分别达59.38%、72.56%和76.28%,U937细胞增殖抑制率分别达38.67%、47.54%和50.59%.琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6小时,Jurkat和U937细胞均呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带; Western blot检测结果发现,随着mDRA-6作用时间延长,Jurkat和U937细胞内促凋亡分子bax增多,抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl减少,Cyt c释放明显增多,同时 caspase-9、caspase-3也显示明显的激活表现.预先使用caspase-9抑制剂孵育细胞1小时,mDRA-6所致Jurkat和U937细胞生长抑制率分别降低了24.36%(t=5.44,P﹤0.01)和20.82%(t=4.29,P﹤0.01),mDRA-6所致Jurkat和U937细胞凋亡率分别降低了32.89%和23.97%.结论:线粒体信号通路激活是抗人死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡的途径之一.
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抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制
目的:探讨抗人死亡受体5(DRS)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制.方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等凋亡相关蛋白的表达情况.结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg,/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势.免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等表达活性增加,并且Cyto C在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象.结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡.本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础.
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免疫沉淀分析抗人DR5单克隆抗体激活白血病细胞caspase8/10
目的:分析抗人死亡受体5(death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6对白血病细胞系Jurkat及U937细胞caspase8、caspase10激活变化.方法:采用Western blot方法检测mDRA-6对Jurkat及U937 细胞caspase-8、caspase-10、caspase-3的激活改变;免疫沉淀方法分析mDRA-6诱导的Jurkat及U937细胞DISC的caspase-8、caspase-10分子;定量-PCR检测Jurkat、U937细胞caspase-8、caspase-10 mRNA表达.MTT法检测caspase-8、caspase-10和caspase-3抑制剂对mDRA-6抑制Jurkat及U937细胞生长增殖的影响;AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测caspase-8、caspase-10抑制剂对mDRA-6诱导细胞凋亡作用的影响;结果:Western blot检测显示,mDRA-6作用Jurkat细胞,导致细胞caspase-8分子激活降解,但对caspase-10无激活改变;mDRA-6作用U937细胞,激活细胞caspase-10分子,但对caspase-8无激活表现;mDRA-6作用Jurkat和U937细胞,caspase-3及PARP均表现出激活降解.免疫沉淀检测发现,mDRA-6作用白血病细胞4h,Jurkat细胞DISC的caspase-8条带明显,caspase-10条带无明显显示;相反,U937细胞DISC的caspase-10条带出现,而caspase-8无明显条带显示.定量-PCR检测发现,Jurkat和U937细胞 caspase-8 mRNA表达无明显差异,但U937细胞 caspase-10 mRNA表达水平明显高于Jurkat细胞(P<0.01).预先使用caspase-8、caspase-10、caspase-3抑制剂孵育细胞1小时,mDRA-6所致的Jurkat细胞生长抑制率分别降低了72.94%(t=20.27,P＜0.01)、8.09%(t=1.82,P＞0.05)和31.20%(t=8.06,P＜0.01) mDRA-6所致U937细胞生长抑制率分别降低了4.53%(t=0.90,P＞0.05)、69.09%(t=17.25,P＜0.01)和50.20%(t=13.06,P＜0.01).AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测发现,预先使用caspase-8、10抑制剂孵育细胞1小时,mDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡率分别降低了80.82%和8.34% mDRA-6诱导的U937细胞凋亡率分别降低2.50%和48.47%.结论:mDRA-6激活不同起始caspase诱导细胞凋亡,激活caspase-8启动Jurkat细胞凋亡,激活caspase-10启动U937细胞凋亡;U937细胞caspase-10激活可能与细胞caspase-10 mRNA高表达有关.
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可溶性死亡受体5在化疗前后肺癌患者外周血中的检测
目的:探讨正常人群外周血清中sDR5及与肺癌患者的差异.方法:采用ELISA夹心法检测106例正常人群、79例肺癌患者与肺癌化疗以后血清中死亡受体5的含量,并运用SPSS软件对其结果进行统计学分析.结果:正常人群外周血清中sDR5平均值为(6.25±3.09) μg/L,肺癌患者的sDR5含量为(53.91±13.42) μg/ml明显高于正常人群,P<0.001.肺癌病人化疗后外周血sDR5水平为(23.99±14.23) μg/ml较治疗前明显下降,P<0.001.结论:外周血中sDR5的消退水平有可能与肿瘤病人发病、发展及预后密切相关.
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死亡受体5和死亡诱骗受体2在腰椎间盘组织中的表达及意义
目的 探讨死亡受体5(DR5)、死亡诱骗受体2(DCR2)在腰椎间盘中的表达及意义.方法 选取腰椎间盘突出症行椎间盘组织摘除术的患者73例作为观察组;另外寻找非正常死亡成人15例取腰椎间盘32个.采用PV6000两步免疫组织化学染色法对两组腰椎间盘进行检测.结果 观察组髓核及纤维环内的DR5细胞阳性率明显高于对照组,两组比较差异明显(P＜0.05)；DCR2细胞阳性率两组比较差异不明显,无统计学意义(P＞0.05).结论 DR5可能参与了腰椎间盘组织的细胞凋亡过程.
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NCTD对白血病细胞DR5表达的影响
目的 研究去甲斑蝥素(NCTD)对白血病细胞死亡受体(DR)5表达的影响.方法不同浓度NCTD处理K562和HL-60细胞16 h后,流式细胞术分析DR5表达和细胞内活性氧(ROS)相对含量;通过免疫印迹技术分析激酶JNK1的表达.结果 NCTD以浓度依赖方式上调DR5表达,细胞内活性氧含量和JNK1表达也随NCTD浓度增大而增加.结论 NCTD可能通过ROS/JNK途径上调DR5表达.
关键词： 去甲斑蝥素 活性氧 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 死亡受体5
