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中国人常见GJB2基因突变片段TA克隆载体构建
目的 应用TA克隆技术构建含中国人常见GJB2基因突变片段的载体,为构建突变绿色荧光蛋白融合载体提供基础.方法 首先利用定点诱变法在体外构建235delC、299-300delAT和176del16bp绿色荧光蛋白非融合载体,以此为模板利用PCR扩增突变基因片段,然后将PCR扩增产物克隆到TA载体上,用限制性内切酶法和测序法鉴定重组质粒序列正确性.结果 用限制性内切酶法和测序方法 证实扩增片段为目的片段.结论 成功地构建了235delC、299-300delAT和176del16bp突变基因片段TA克隆载体,为构建突变绿色荧光蛋白融合载体、进一步研究突变致聋机制奠定了基础.
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DR5在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗表达分布及年龄相关性变化
目的研究GJB2基因条件敲除（cCx26Pax2Cre）小鼠耳蜗DR5表达情况，探讨GJB2基因突变导致耳聋的机制。方法 cCx26Pax2Cre小鼠为实验组，BALB/C小鼠为对照组，分别取P8、P12和P21时小鼠耳蜗行冰冻切片，利用荧光标记免疫组织化学方法和激光共聚焦显微镜技术观察死亡受体5（death receptor，DR5）蛋白在耳蜗的表达情况，用Image Pro Plus 6.0计算平均光密度值，SPSS 18.0进行统计分析。结果 P8时DR5主要表达在柯蒂氏器外侧的支持细胞、耳蜗外侧壁Ⅱ型纤维细胞、盖膜，随着日龄的增加，表达逐渐向内侧延伸到内侧支持细胞，P12和P21时还出现了螺旋缘、毛细胞、螺旋神经节细胞、螺旋凸DR5表达阳性，而且表达强度随日龄增加而逐渐变强。在野生小鼠DR5也有表达但较弱。与野生型小鼠相比， cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗蜗轴螺旋管内神经纤维DR5表达的光密度值明显增大，经统计学分析两者具有显著性差异（P<0.05）。结论 cCx26Pax2Cre小鼠缝隙连接功能异常，可能导致耳蜗细胞出现葡萄糖短缺，导致三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate， ATP)不足，引起DR5的表达上调，直接激活凋亡的死亡受体途径，或间接激活线粒体通路使凋亡信号进一步放大，导致耳蜗细胞凋亡的发生，终引起cCx26Pax2Cre小鼠听力下降。
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中国人常见非综合征性聋杂合子发病机制的实验研究
目的 构建人野生型Cx30红色荧光表达载体,将Cx26野生型和突变型分别与Cx30共同转染HEK293细胞,为揭示Cx26-235 deIC的杂合突变患者的发病机制提供实验依据.方法 构建pCx30-IRES2-DsRed-Express真核表达载体,将pCx30-IRES2-DsRed-Express分别与pCx26-EGFP或pCx26-235deIC-EGFP以1:1的比例用脂质体法转染HEK293细胞,转染48 h后在激光共聚焦显微镜下观察结果,计算同时表达红色和绿色的细胞阳性率,卡方检验比较两组阳性率的差异.结果 pCx30-IRES2-DsRed-Express与pCx26-EGFP共同转染HEK293细胞后,同时出现红色和绿色荧光的细胞占全部转染阳性细胞的27.32%(91/333).pCx30-IRES2-DsRed-Express与pCx26-c235 deIC-EGFP共同转染HEK293细胞后,同时表达红色与绿色信号的细胞占全部阳性细胞的2.1 9%(4/183),明显低于两种野生型质粒共同转染的阳性率,经卡方检验两者差异具有显著性意义(χ2=52.89,P<0.01).结论 Cx26发生C.235 deIC突变后,丧失了与野生型Cx30形成异型性缝隙连接gap junctions,GJs)的能力,使异型性GJs的总数显著下降,导致耳蜗失去了重要的细胞间联系通道,推测可能与部分c.235 deIC杂合子耳聋的发生有关.
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缝隙连接蛋白26基因修饰对人高转移性肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响
目的：探讨缝隙连接蛋白（Cx）26基因对人高转移性肝癌细胞株（HCCLM3）细胞增殖和侵袭能力的影响。方法采用慢病毒载体（ LV）转染法将载体LV-Cx26转染高转移性 HCCLM3细胞为研究组，仅转染空载体 LV-NC-Cx26为对照组，未转染的 HCCLM3细胞为空白组。 RT-PCR和Western印迹测定转染后Cx26 mRNA和蛋白表达；划痕荷载染料传输实验检测细胞通讯功能；流式细胞术检测细胞周期并通过CCK-8增殖实验、Transwell细胞侵袭实验检测细胞增殖、侵袭能力。结果研究组Cx26 mRNA和蛋白表达量均明显高于对照组和空白组（ P＜0.05）。研究组转染慢病毒载体LV-Cx26后的细胞通讯功能明显强于对照组、空白组，即划痕细胞中的荧光染料可传递到相邻的3～4列细胞。研究组 G0／G1期细胞数明显多于对照组和空白组，S期细胞数明显少于对照组和空白组（ P＜0.05）。 M期三组细胞数无统计学差异（ P＞0.05）。 CCK-8法检测显示，72 h起研究组细胞增殖速度明显低于同期对照组和空白组（P＜0.05）；对照组和空白组各时间点细胞增殖情况无统计学差异（P＞0.05）。 Transwell 细胞侵袭实验显示，研究组穿膜细胞数明显少于对照组和空白组（ P＜0.05）。结论转染Cx26基因可有效抑制HCCLM3细胞的增殖和侵袭能力，降低恶性生物学特征，可成为晚期肝癌治疗的新思路。
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慢病毒靶向干扰Cx26抑制人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移
目的：探讨缝隙连接蛋白26（connexin 26，Cx26）对人高转移性肝癌 HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。方法构建Cx26干扰慢病毒载体感染HCCLM3细胞，用嘌呤霉素筛选稳定干扰 Cx26表达的靶细胞，通过 Real-time PCR和Western blot鉴定Cx26的mRNA和蛋白表达情况；用“parachute”荧光示踪法检测细胞缝隙连接（gap junc-tion，GJ）功能；用MTT法、流式细胞术、Transwell迁移实验分别检测干扰Cx26对HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。结果 LV-Cx26组的Cx26 mRNA和蛋白表达明显低于LV-NC组和野生组细胞（P＜0.01），并且LV-Cx26组的GJ功能也较LV-NC组和野生组明显减弱（P＜0.01）。干扰Cx26可明显抑制HCCLM3细胞增殖（P＜0.01），促进HC-CLM3细胞凋亡（P ＜0.01），降低其体外迁移能力（P ＜0.01）。结论慢病毒靶向干扰Cx26表达可明显减弱其GJ功能，并抑制高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移能力，促进凋亡，降低其恶性生物学特性。
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缝隙连接蛋白26对小鼠噪声易感性的影响
目的 探讨降低耳蜗缝隙连接蛋白26 (connexin 26,Cx26)表达对暴露于噪声环境中小鼠噪声易感性的影响.方法 条件诱导性Cx26基因敲除新生小鼠32只,随机分为空白组、他莫昔芬(tamoxifen,TMX)组、噪声组、噪声+TMX组各8只,TMX组于出生第18天给予单次TMX(1.5 mg/10 g)皮下注射;噪声组于出生第24天开始暴露于100 dB声压级(sound pressure level,SPL)稳态白噪声中,每日连续8h,持续7d;噪声+TMX组于出生第18d天给予单次TMX(1.5 mg/10 g)皮下注射,出生第24天开始暴露于100 dB SPL稳态白噪声中,每日连续8h,持续7d;空白组不作处理.分别于实验前(出生第15天)、实验结束后(出生第30天)检测4组小鼠宽带短声(Click)及频率为8、16、32 kHz短声听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)的反应阈;实验结束后处死小鼠,迅速断头取出双侧耳蜗,Western blot法检测Cx26蛋白表达.结果 4组实验前Click及8、16、32 kHz频率短声ABR反应阈比较差异均无统计学意义(P＞0.05);噪声+ TMX组实验结束后Click[(42.08±5.42) dB SPL]及8、16、32 kHz频率短声ABR反应阈[(47.08±5.82)、(62.92±9.16)、(84.58±4.98) dB SPL]均高于噪声组[(29.38±4.03)、(40.63±6.80)、(39.06±7.35)、(56.25±12.45) dB SPL]、TMX组[(21.50±5.80)、(28.50土4.74)、(25.50±4.97)、(37.50±7.17) dB SPL]、空白组[(24.58±5.82)、(28.33±6.51)、(29.17±3.59)、(39.17±8.75) dB SPL](P＜0.05),且噪声组高于TMX组和空白组(P＜0.05),TMX组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05);实验结束后耳蜗Cx26蛋白表达在噪声+TMX组(0.710±0.175)、噪声组(0.774±0.157)、TMX组(0.851±0.087)均低于空白组(1.117±0.114) (P＜0.05),噪声+TMX组、噪声组、TMX组耳蜗Cx26蛋白表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 降低耳蜗Cx26蛋白表达可增加小鼠对噪声的易感性.
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出生后大鼠耳蜗不同发育阶段connexin26蛋白的表达
目的:研究缝隙连接蛋白26(cx26)在出生后大鼠耳蜗不同发育阶段的分布.方法:采用免疫组织化学SP法检测cx26在36只大鼠(1周龄组、3周龄组和9周龄组各12只)耳蜗的表达.结果:cx26在3组均有较强的表达,阳性表达主要分布于耳蜗外侧壁血管纹和螺旋韧带,Corti氏器中的支持细胞间以及毛细胞和支持细胞间,螺旋缘以及螺旋神经节细胞.cx26在大鼠耳蜗外侧壁、Corti氏器与螺旋神经节的阳性细胞平均积分光密度3组间两两比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论:大鼠耳蜗发育过程中cx26的表达趋于稳定,没有随着听力的发展而变化.
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肝再生磷酸酶-3上调缝隙连接蛋白26诱导结肠癌LoVo细胞间质上皮化
目的 探讨在结肠癌肝转移的肿瘤微环境中肝再生磷酸酶-3(PRL-3)对缝隙连接蛋白26(Cx26)的影响及促进结肠癌细胞间质上皮化(MET)的机制.方法 将稳定转染PRL-3的LoVo细胞(LoVo-P)、对照组(LoVo-C)分别和肝细胞(L02)模拟肿瘤微环境进行体外共培养0～3d后,Western blot检测Cx26、上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)的蛋白表达.Transwell侵袭小室法检测LoVo细胞侵袭能力变化.采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测20例Ⅳ期结肠癌及肝转移灶中Cx26和E-cadherin的表达.结果Western blot检测结果显示,LoVo-P细胞经共培养后Cx26的蛋白表达分别上升31.03％、58.39％、93.95％(P＜0.05),E-cadherin蛋白表达明显上升,N-cadherin蛋白表达受到抑制(P＜0.05),对照组中蛋白表达变化不明显.经过共培养后LoVo-P细胞侵袭能力明显降低(P＜0.05).免疫组织化学结果显示,Cx26和E-cadherin在肝转移灶中的阳性表达率(65％和75％)高于原发灶(40％和45％),差异有统计学意义(P＜0.05).在结肠癌肝转移灶中Cx26和E-cadherin呈正相关(r=0.545,P＜0.05).结论 在共培养环境中PRL-3能通过上调Cx26诱导LoVo细胞MET并降低其侵袭能力.
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中国人常见GJB2基因突变表达载体的构建及鉴定
目的:构建中国人常见GJB2基因突变235 de1C、299-300 delAT和176 de1 16 bp与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达载体,寻找体外研究GJB2基因缺失突变致聋机制的有效途径.方法:用体外定点突变法构建235 de1C、299-300 delAT和176 de1 16 bp突变全序列与EGFP表达载体,以此为模板PCR扩增突变有效表达序列,将PCR产物连接到pMD19-T载体中,EcoRI/BamHI双酶切克隆载体,测序鉴定序列正确性后,将酶切产物插入pEGFP-N1载体中,脂质体转染HEK293细胞,荧光显微镜观察表达的融合蛋白.结果:GJB2基因突变235 de1C、299-300 delAT和176 de1 16 bp在HEK293细胞中高效表达,表达主要位于细胞质中.结论:成功构建了中国人常见GJB2基因突变235 de1C、299-300 delAT和176 de1 16 bp与EGFP的融合蛋白表达载体,为进一步研究其致聋机制奠定了基础.
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缝隙连接蛋白26缺陷聋的神经细胞中缝隙连接蛋白的表达差异
目的:通过诱导多能干细胞(iPSCs)技术获得缝隙连接蛋白26(Cx26)缺陷聋患儿的神经细胞,研究Cx26缺陷对神经细胞发育和基因表达的影响.方法:从3例Cx26缺陷造成的极重度耳聋患儿取得成纤维细胞,将之诱导为数个非整合iPSC细胞系,鉴定这些细胞系的形态和内源性、外源性基因表达.然后将这些细胞系向神经细胞方向分化,检测整个过程中形态、多能性基因、神经标记物、缝隙连接蛋白基因表达变化.结果:能够成功建立Cx26缺陷的3个iPSC细胞系,并且可以在体外分化为神经前体细胞和神经元细胞;这些细胞的形态、增殖、内源性、外源性基因表达与人胚胎干细胞基本一致;iPSC细胞系分化出的神经元细胞中,Cx32的表达明显上调,Cx36的表达略微上调,Cx26的表达没有明显变化.结论:Cx26缺陷不影响诱导多能干细胞的神经分化,但其过程中Cx32和Cx36表达上调,提示Cx32可能对Cx26缺陷发挥了代偿作用.
关键词： 缝隙连接蛋白26 缝隙连接蛋白32 非整合诱导多能干细胞 疾病模型 -
G JB 2基因条件敲除小鼠耳蜗凋亡相关基因表达差异研究
目的：研究GJB2基因条件敲除（cCx26Pax2Cre ）小鼠耳蜗膜迷路细胞中凋亡相关基因的差异性表达情况，探讨GJB2基因突变导致耳聋的机制。方法由Cx26loxp／loxp和Pax2Cre／＋小鼠杂交产生的cCx26Pax2Cre小鼠为实验组，野生型BALB／C小鼠作为正常对照组，两组分别选取 P10和 P18小鼠各3只，提取耳蜗膜迷路总RNA ，反转录成cDNA ，用QRT -PCR Array检测两组与凋亡相关的84个功能基因的表达差异。结果与野生型小鼠相比，cCx26Pax2Cre小鼠在P10时，共有16个基因表达有生物学意义（19．05％，16／84），其中14个基因表达下调（87．5％，14／16），包括9个抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的基因下调和5个促进细胞凋亡和炎症反应的基因下调，2个基因表达上调（12．5％，2／16），均为促进细胞凋亡的基因，此期促进细胞凋亡的趋势十分明显；在 P18时，共有4个基因（4．76％，4／84）表达变化有生物学意义，包括3个基因表达下调（75％），全部为抑制细胞凋亡的基因（100％），1个基因表达上调（25％），为促进细胞凋亡的基因，总体趋势仍为促进细胞凋亡的发生。与 P10相比， cCx26Pax2Cre小鼠P18时耳蜗组织中共6个基因表达变化有生物学意义，其中促进细胞凋亡的caspase-8基因和抑制细胞凋亡的No13基因表达上调（33．3％，2／6），4个基因表达下调（66．7％，4／6），包括促进细胞凋亡的 T n-frsf10b、Cideb基因和抑制细胞凋亡的CD40、Bc110基因。结论 GJB2基因敲除后，可能通过上调死亡受体5（death receptor 5，DR5）激活死亡受体途径直接导致细胞凋亡，同时也可能通过caspase-8间接激活线粒体通路使凋亡信号进一步放大，终引起cCx26Pax2Cre小鼠耳蜗细胞的广泛缺失和听力下降。
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GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时程观察
目的 探讨GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗毛细胞缺失方式和具体时间.方法 GJB2基因条件敲除小鼠cCx26loxp/loxp-Pax2-Cre(cCx26)由转基因小鼠Cx26loxp/loxp与 Cx26loxp/--Pax2-Cre小鼠杂交获得,分别选取P8、P14、P18和P21四个发育阶段各6只小鼠进行实验.野生型BALB/c小鼠作为正常对照.常规解剖出耳蜗基底膜,鬼笔环肽-FITC及碘化丙啶(PI)分别染色、铺片,激光共聚焦显微镜观察、拍照.结果 与野生型小鼠相比,cCx26小鼠P8时耳蜗外毛细胞纤毛、细胞核形态均未见明显异常改变;P14时,鬼笔环肽染色显示耳蜗中回表皮板疏松,外毛细胞纤毛染色开始不规则,PI染色外毛细胞核排列极性欠佳,细胞核着色不均匀,可见深染的胞核,尚未见明显的外毛细胞缺失;P18时,鬼笔环肽染色显示表皮板出现区域性的模糊和单个外毛细胞纤毛的消失,外毛细胞核出现皱缩、片断化,甚至缺失,这一改变以中回为明显,底回次之,顶回改变轻微;P21时,表皮板出现了片状缺失,外毛细胞丢失明显,残余细胞排列紊乱.与野生型小鼠相比,cCx26ko小鼠各阶段内毛细胞纤毛染色不规则,深浅不一,细胞核未见明显形态异常及缺失.结论 GJB2基因缺失可引起小鼠耳蜗Corti器表皮板破损以及外毛细胞的凋亡,表皮板及外毛细胞纤毛的变化开始于P14,P18时外毛细胞出现典型的凋亡表现.
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GRP78/Bip在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗中的表达
目的 研究GRP78/Bip在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗中的表达,探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与非综合征型聋的相关性.方法 敲基因小鼠(6只)Cx26loxp/loxp;Pax2 Cre/+ (cCx26)为实验组,野生型BALB/c小鼠(6只)为正常对照组,两组分别选取P8、P12和P21小鼠各2只进行实验.采用耳蜗冰冻切片,免疫组化法检测耳蜗切片中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein,GRP78)的表选.结果 cCx26小鼠耳蜗的GRP78/Bip表达定位与对照组相同,但在P8和P12时cCx26小鼠耳蜗表达更强,到P21时,在盖膜、耳蜗外侧璧GRP78/Bip表达较对照组减弱,而在顶回仅存的不成熟Corti细胞团中,GRP78/Bip表达与对照组接近.结论 GJB2 基因条件敲除小鼠耳蜗发育成熟之前,其耳蜗中GRP78/Bip表达增高,ERS可能参与了GJB2基因突变导致的非综合征型聋的发生过程.
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慢病毒介导shRNA靶向下调Cx26表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化及侵袭的影响
目的：探讨慢病毒介导shRNA靶向下调缝隙连接蛋白26（Cx26）表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化（EMT）及侵袭的影响。方法用慢病毒介导Cx26-shRNA感染SK-Hep-1细胞并用嘌呤霉素筛选稳转细胞。荧光定量PCR和Western blot检测干扰效率。光镜观察细胞形态改变。Western blot检测EMT上皮标志物E-cadherin、间质标志物vimentin的蛋白表达水平。Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。结果成功建立稳定下调Cx26表达的SK-Hep-1细胞（shRNA-Cx26组），与感染EGFP空载体（shRNA-control组）及未感染的SK-Hep-1细胞（blank-control组）比较，其Cx26 mRNA和蛋白表达均明显降低（P<0.01），间质细胞形态转变为上皮细胞形态，E-cadherin蛋白表达明显增多、vimentin蛋白表达明显减少（P<0.01），体外侵袭能力也显著降低（P<0.01）。结论靶向下调Cx26表达能抑制人高侵袭性肝癌SK-Hep-1细胞的EMT和体外侵袭。
