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中国人常见GJB2基因突变片段TA克隆载体构建
目的 应用TA克隆技术构建含中国人常见GJB2基因突变片段的载体,为构建突变绿色荧光蛋白融合载体提供基础.方法 首先利用定点诱变法在体外构建235delC、299-300delAT和176del16bp绿色荧光蛋白非融合载体,以此为模板利用PCR扩增突变基因片段,然后将PCR扩增产物克隆到TA载体上,用限制性内切酶法和测序法鉴定重组质粒序列正确性.结果 用限制性内切酶法和测序方法 证实扩增片段为目的片段.结论 成功地构建了235delC、299-300delAT和176del16bp突变基因片段TA克隆载体,为构建突变绿色荧光蛋白融合载体、进一步研究突变致聋机制奠定了基础.
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人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建
目的:应用体外基因拼接及TA克隆技术构建含PRKAG2基因的载体.方法:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC 068598),其在N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM_016203),设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,将得到的阳性克隆测序鉴定.结果:拼接出全长1759bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致.结论:成功的构建了全长人PRKAG2基因的TA克隆,为进一步研究PRKAG2基因的功能提供了模板.
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pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化
目的:利用中间载体pGEM-T easy vector 构建表达型载体pET15b-EGFP ,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化.方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cDNA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3'端加"A",将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增﹑酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP.用XhoI和BamHI分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP.将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质. 结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP.pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 ml菌液,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP.结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础.
关键词： TA克隆载体 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 重组质粒 蛋白表达 蛋白纯化 -
利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒
目的:利用pGEM-T Easy vector构建 pET15b-SOD1 重组质粒.方法: 以pBluescript II SK-SOD1质粒为模板, 应用pfu DNA 聚合酶,聚合酶链反应法(PCR) 扩增SOD1 cDNA.将扩增的SOD1 cDNA 与三磷酸脱氧腺苷(dATP) 反应,然后通过Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在SOD1 cDNA的3'末端加"A"并纯化,然后将纯化后的SOD1 cDNA与pGEM-T Easy vector直接连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,蓝白筛选,挑选白色克隆扩增、鉴定,重组的质粒命名为 pGEM-T Easy-SOD1.pGEM-T Easy-SOD1 和 pET15b 分别用Xho Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切, 采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片断,前者回收470 bp 的SOD1 cDNA片段,后者回收线性化的 pET15b 片段,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,抽提后的重组体质粒命名为pET15b-SOD1,然后对pET15b-SOD1进行酶切和核苷酸序列测序鉴定.结果:重组质粒pET15b-SOD1经测序分析证实:克隆入pET15b-SOD1的人SOD1 cDNA与GeneBank"AB087266"登录的人SOD1 cDNA序列一致,从而成功构建了pET15b-SOD1 重组质粒.结论:pET15b-SOD1重组质粒的构建为细胞穿透肽介导的SOD1转导提供了一对照载体.
