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抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达
目的筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组B抗原(r-AgB)的人源单链可变区抗体(ScFv),为细粒棘球蚴B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径. 方法采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的细粒棘球蚴B抗原为固相抗原,经过5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗r-AgB的ScFv基因片段的阳性克隆,提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体上,转化大肠杆菌XL1-Blue,经IPTG诱导,表达可溶性ScFv. 结果筛选得到的ScFv片段基因为768 bp,经SDS-PAGE鉴定,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的ScFv分子质量约28 ku,经过ELISA和Western-Blot检测,该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性. 结论细粒棘球蚴重组B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功,为今后包虫病人源抗体的研究和应用奠定了基础.
关键词： 噬菌体展示 人源单链可变区抗体 细粒棘球蚴重组B抗原 表达 -
抗棘球蚴人源单链可变区抗体抑制人体包虫原头节的初步实验
目的建立人体包虫原头节的体外培养模型,评价抗棘球蚴人源单链可变区抗体(ScFv)抑制人体包虫原头节的效果. 方法无菌抽取人体包虫囊肿原头节,与ScFv高(1mg/L)、中(0.1mg/L)、低(0.01mg/L)剂量组和对照组(等量的培养液)共同培养,比较各组原头节死亡率和残余ScFv浓度,观察原头节形态学改变. 结果高剂量ScFv组原头节死亡率与对照组的差异均有统计学意义(P<0.01),但中、低剂量组与对照组死亡率的差异无统计学意义(P>0.05),随作用天数增加,高剂量ScFv组原头节结构逐渐被破坏、皱缩、崩解. 结论该ScFv具备体外抑制人体原头节的作用,其抑制作用与剂量和时间有关.
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抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选、鉴定和免疫活性检测
近年来,随着噬菌体抗体表面展示技术的不断发展,人们正广泛应用该技术研制各种人源噬菌体单链抗体.单链抗体仅为完整抗体的六分之一[1,2],因其具有分子小、容易进入病灶周围的微循环及在肾脏内清除异物快等优点,在疾病的治疗方面引起广泛重视.本研究利用该技术,成功地筛选到了抗细粒棘球蚴重组B抗原的人源单链可变区抗体,并对其特异性进行了鉴定.
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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-Id scFv),为研制HCV E2的抗-Id scFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCV E2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCV E2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCV E2特异性抗-Id scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-Id scFv与HCV E2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(E11 A450 nm 0.928,E14 A450 nm 1.152,E17 A450 nm 1.136,E28 A450 nm 1.163,E53 A450 nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11 A450nm 0.044,E14 A450 nm 0.062,E17 A450 nm 0.166,E28 A450nm 0.012,E53 A450 nm 0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(E28)阳性克隆提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCV E2的抗-Id scFv,本实验结果为开展用抗-Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.
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抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定
目的 筛选生物素化三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究相关快速检测试剂盒创造条件.方法 本试验利用生物素化三聚氰胺为包被抗原,从半合成噬菌抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体片段.即采用菌噬体表面展示技术,以链亲和素-生物素标记的三聚氰胺为固相包被靶抗原,把靶抗原包被在免疫平板上,加入噬菌体抗体库,则头部带有能与靶抗原特异性结合的抗体分子的噬菌体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉;将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠杆菌,就可以得到含抗体基因的噬菌粒.结果 从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程后,获得抗原特异性和结合性较强的生物素化三聚氰胺scFv片段.结论酶联免疫吸附试验等进行鉴定后,筛选得到了抗生物素化三聚氰胺的噬菌体抗体基因片段,为下一步亲和力鉴定、蛋白表达及开发相关检查试剂盒奠定了基础.
