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豚鼠鼻粘膜一氧化氮合酶表达
一氧化氮(nitric oxide, NO)是新近发现的一种具有多种而复杂生物学活性的小分子物质,是生物体内重要的信使分子和效应分子,参与体内众多的生理病理过程。NO具有松弛血管平滑肌、调节血液循环、抑制血小板聚集等作用,并被认为是一种重要的神经递质[1]。催化NO的生物合成酶称一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS),本检测旨在探索NOS在鼻粘膜上的分布及其生理学意义。 一、材料和方法 1.豚鼠12只,发育营养正常,雌雄不论,体重350 g左右(本校动物实验中心提供)。 2.制片:豚鼠灌注固定处死后,迅速取下双侧鼻甲粘膜,分别置入10%中性甲醛固定,1侧鼻粘膜6 h后移入15%蔗糖过夜,鼻粘膜包埋在OCT水溶性包埋剂中,做5 μm厚的冰冻切片;另1侧硅烷化载玻片行4 μm石蜡切片。 3.酶组织化学染色:冰冻切片过0.01 mol/L 的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)后,待其干燥,加入含有0.8 g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠(nicotinamide dinucleotide phosphate-Na4,NADPH-Na4, 美国Sigma公司)、0.6 g/L的硝基四氮醋蓝和0.3% Triton-X100的孵育液,置于37℃恒温箱内孵育1.5 h,显色后0.01 mol/L磷酸缓冲溶液冲洗3次,终止反应,常规酒精脱水、透明、封片。阴性对照:孵育液内不含NADPH-Na4。 4.内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS)原位杂交检测步骤:采用eNOS原位杂交检测试剂盒(武汉博士德公司)。石蜡切片脱腊至水,蛋白酶K消化5 min,暴露mRNA核酸片段,cDNA双链探针变性后,每张切片加10 μL含地高辛标记探针的eNOS原位杂交液,湿盒中37℃杂交18 h,充分洗涤后,用免疫组化ABC法显示探针与鼻粘膜靶核酸形成的杂交体。阴性对照为省去滴加eNOS探针杂交液,其余方法和步骤不变。
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酸性液对大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用
心肌缺血导致心肌细胞严重的酸中毒,复灌后细胞内外pH值的急剧变化(即"pH反常")在心肌损伤中起重要作用.我们的实验资料表明,用酸性液复灌对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤有保护作用[1].本实验进一步分离成年大鼠心肌细胞并复制缺氧-复氧损伤模型, 观察复氧时用不同pH值孵育液对缺氧-复氧损伤的影响.
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精液中炎性细胞对精子运动功能的影响
材料与方法:人精液标本6份,总活率大于50%,a级+b级精子≥38%.过氧化物酶甲苯胺蓝法证实白细胞总数小于106 ml-1.1∶2(体积比)加入孵育液,300×g离心15 min,弃上清,重复操作操作3次.调节细胞浓度至20×106个/ml.取24孔板每孔加入0.5 ml,实验组加入L-NAME,终浓度为1 mmol.L-1,37 ℃孵育.不同时间观察精子活动率的变化.孵育结束后Gresis试剂测定上清液中NO的生成.
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制作肾冰冻切片时琥珀酸脱氢酶的显色
琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸钠脱H+,而使孵育液中的四氮盐接受此H+后还原成有色的二甲臜[1].
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光镜酶组织化学方法中两点技术小改进
光镜酶组织化学方法广泛用于病理、科研及药物毒性检验。冰冻切片法是光镜酶组织化学方法中常用的重要技术,本人在实验过程中有如下两点技术小改进。(1)组织切片要求有一定的厚度才能有效地进行酶反应,厚片在孵育液中常从玻片上脱落下来。……
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异硫氰酸苯酯衍生法测定孵育液中的3-甲基组氨酸与酪氨酸
目的:探讨用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法高效液相色谱检测3-甲基组氨酸(3-MH)和酪氨酸(Tyr). 方法:将PITC作为高效液相色谱柱前衍生剂,干燥后存放在冰箱,样品进样后,用乙酸钠和乙腈作为二元梯度洗脱50 min完成分析. 结果:本实验中建立的方法3-MH和Tyr均具有良好的线性,相关系数分别为0.9991与0.9992,回收率为82.6%与87.6%. 结论:PITC衍生法高效液相色谱检测3-MH和Tyr稳定可靠,灵敏度高,PITC是一种理想的衍生剂.
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化学因素对动脉组织肾上腺髓质素合成与释放的影响
肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)是新发现的一种内源性多肽,具有多种生物学作用.我们曾报告哮喘急性发作期和慢性阻塞性肺病(COPD)患者血浆AM升高[1~2],但机制不清楚.由于这两种疾病常伴有细菌感染、低氧血症及酸中毒,因此本实验在大鼠动脉孵育液中设计了类似的环境,旨在通过测定不同条件下孵育液和孵育组织中AM含量,以探讨AM合成与释放的影响因素.
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HPLC/MS/MS法测定大鼠肝微粒体系统中非那西丁及其代谢物的浓度
目的:以高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠肝微粒体孵育液中非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的浓度.方法:色谱柱为XTerra MS C18,流动相为甲醇-0.1%甲酸不同比例梯度洗脱,流速为0.2mL·min-1;质谱仪为电喷雾-三重四极杆质谱,以多反应监测方式采集数据.结果:非那西丁和对乙酰氨基酚的检测浓度线性范围分别为45~9 000(r=0.999 8)、15.2~1 520 ng·mL-1 (r=0.999 6);平均回收率分别为(96.2±2.3)%~(98.3±2.4)%、(99.6±2.1)%~(100.2±2.6)%;日内及日间精密度均小于5%,低检测浓度分别为9、10 ng·mL-1.结论:本法简单、快速、灵敏,适宜于检测大鼠肝微粒体孵育液中非那西丁及其代谢物浓度.
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骨骼肌m-ATPase染色改良法
我们在实验中发现,用常规的钙钴法很少能保存骨骼肌中ATP酶的活性,且ATP酶对固定非常敏度;而使用未固定的材料骨骼肌中常出现人工假象.固定液的张力很重要,而蔗糖是把张力提高到足够水平的适当添加物.我们将原ATP酶钙钴法作了如下改进:1.固定:将新鲜骨骼肌组织用双面刀片切成约1mm厚的薄片,入固定液中固定10mi n,4℃.固定液配制:多聚甲醛4g;二甲砷酸钠3.08g;氯化钙0.75g;蔗糖 11.5g;双蒸水加至100ml,调节pH值为7.2.2.OCT包埋,-20℃恒冷箱切片(8μm),室温下自然干燥30min.3.切片预处理15min.预处理液配制:0.1mol/L巴比妥钠水溶液2ml,0 .18mol/L氯化钙水溶液2ml,蒸馏水6ml,用0.1mol/L NaOH调节至pH10.35.4.入孵育液60min至75min.孵育液配制:0.1mol/L巴比妥钠2ml; 0.18mol/L氯化钙1ml;蒸馏水7ml;ATP.Na230mg;调节pH 为9.4.5.1%氯化钙洗3次,共10min.6.入2%氯化钴3min.7.蒸馏水充分漂洗.8.入2%硫化铵2min.9.流水冲洗.10.脱水、透明、封片.结果:酶活性反应为不同色调黑褐色,Ⅰ型纤维色淡,Ⅱ型纤维色深.改良后的优点:在冷冻之前,用薄片固定的方法替代了液氮、异戊烷冷冻组织,既节约了开支,又使操作简便,且减少了组织中的冰晶出来;酶活性部位显色深,定位准确.
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细胞色素氧化酶的DAB法与Nadi反应的比较
过去常用经典的Nad i反应显示细胞色素氧化酶以定位线立体的存在部位,现在广泛使用DAB法.我们对这两种方法进行了比较.方法如下:取Wistar大鼠的心、肝、肾组织,用液氮骤冷,恒冷箱切片(厚7μm),进行以下实验:Nadi反应:切片入孵育液(N-苯基-对-苯二胺3mg、1-羟基-2-萘酸3mg 溶于二甲基亚砜0.1ml,0.05M的磷酸缓冲液pH7.2 10ml,混匀后过滤 )室温30min.入Lugol碘液2min,入5%硫代硫酸钠4min,入1%醋酸钴60min,蒸馏水洗,甘油明胶封固.DAB法:切片入孵育液(0.05M磷酸缓冲液pH7.2 10ml,3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)9mg,细胞色素C 15mg,混匀后过滤)室温5min .切片用缓冲液清洗,入蒸馏水,甘油明胶封固.HE染色:切片先用10%Formalin固定10min,再做常规HE染色.对照:Nadi反应和DAB法都用迭氮钠预孵育5min(10ml缓冲液中含6mM迭氮钠),再入含6mM迭氮钠的孵育液中孵育,以下的步骤与上述步骤相同.DAB法还用不含细胞色素C的孵育液做对照.实验结果:HE染色的切片显示组织结构正常.Nadi反应的阳性产物为黑绿色的颗粒, 可见弥散的现象.DAB染色的阳性产物为棕色颗粒,很少见有弥散现象.对照切片的结果:用迭氮钠制酶活性的Nadi反应有弱阳性产物,而用迭氮钠的DAB法细胞色素C的切片均呈阴性反应.我们认为显示细胞色素氧化酶的经典方法Nadi反应存在反应产物弥散的现象,用迭氮钠抑制酶的活性后仍有阳性产物出现,因而该法只能表明线粒体的存在,而其定位不够准确.DAB法的方法简便,反应产物不易扩散,可较准确地定位线粒体的存在部位.另外,DA B的沉淀物能与四氧化锇反应形成锇黑,可用于电镜观察.经以上的实验观察和比较,我们认为无论从反应的特异性、定位的准确性,还是电镜应用性等方面看,显示细胞色素氧化酶的DAB法都优于Nadi反应.