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产前诊断技术的研究进展
产前诊断是优生优育和预防缺陷儿出生的重要手段.它是在遗传咨询的基础上,应用现代生物学、生物化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学等技术,通过母体检查或对胚胎(胎儿)直接检测,了解胎儿在子宫内的生长发育状况,诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形.本文就各种产前诊断方法、新技术、存在的不足与困难、以及发展前景综述如下.
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无创产前基因诊断方法研究进展
产前诊断又称宫内诊断,是指在胎儿出生前,通过影像学、生物化学、细胞遗传学以及分子生物学等技术,了解胎儿宫内的发育状态,对先天性缺陷或遗传性疾病作出诊断.产前诊断是预防严重遗传性疾病或先天性缺陷胎儿出生的一项有效而可靠的措施,是优生和提高人口质量的重要保障之一.产前诊断方法根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为创伤性和无创性.前者主要包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样、胎儿镜和胚胎活检等,虽然诊断精确度较高,但可导致流产或感染等并发症,常在高危孕妇中实施;后者包括超声波检查、直接从母体外周血中获取胎儿细胞、胎儿游离DNA[1]或游离RNA检测,该法既能行产前诊断又无危险性,尽早发现和杜绝异常胎儿,亦适用于大群体筛查,达到优生目的.近年来,胎儿游离核酸和有核细胞结合基因检测取得较大进展,本文就无创产前基因诊断的研究材料、方法学及其产前诊断中的应用进行综述.
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套式聚合酶链反应技术检测孕妇外周血中胎儿细胞
目的探讨利用孕妇外周血中胎儿细胞进行产前诊断的可行性.方法采用套式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增孕妇外周血中男性胎儿性别决定基因(sexdetermining region Y,SRY),并与胎儿实际性别相对照.结果 74例孕7~40周的孕妇中38例怀男眙,其中23例扩增出Y特异带;另外36例怀女胎孕妇中,仅1例出现Y特异带.SRY套式PCR扩增系统在孕中期,孕晚期检查孕妇外周血中男胎灵敏度(72.7%、71.4%)、特异度(100.0%)和符合率(87.o%、90.5%)高,误诊率为0,而在孕早期灵敏度(50.0%)、特异度(90.0%)及符合率(63.3%)较低,误诊率(10.0%)、漏诊率(50.0%)较高.结论胎儿细胞在孕早期即存在于孕妇外周血中,但直接利用孕妇外周血中胎儿细胞检查SRY基因的检出率较低.
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无创性产前诊断的研究进展
妊娠孕妇外周血中或宫颈管内存在有胎儿细胞或遗传物质,利于各种方法富集它们并进行遗传分析,检测胎儿遗传病及染色体病,可达到无创性产前诊断的目的.
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利用母血中胎儿细胞进行无创产前诊断的研究进展
无创性产前诊断方法是近年来围产医学领域研究的热点.母血中的胎儿细胞具有包含完整的胎儿基因组、不受母血DNA污染的优点.然而,胎儿细胞的数量稀少,很难应用于临床.近年来,测序和微序列分析等分子细胞遗传学技术的发展,为利用少数几个胎儿细胞诊断遗传病提供了可能.本文就胎儿细胞的发现、富集、鉴定、分析以及在无创性产前诊断的应用现状进行综述.
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三种特异性抗体结合流式细胞术分选母血中胎儿细胞方法的评价
研究证实母血中的游离胎儿细胞可用于无创性单基因病产前诊断[1,2].胎儿细胞仍是检测胎儿染色体异常的惟一来源[3],虽然母血中胎儿有核红细胞(FNRBC)数量很少,但其特异性形态在正常人外周血中极罕见,并可携带完整的胎儿基因.因此,建立富集母血中胎儿细胞的方法则是无创性产前诊断的关键.本研究用3种FNRBC特异性抗体和流式细胞术分选胎儿细胞,并通过计算FNRBC准确率和特异性,以评价分选母血中胎儿细胞的适宜方法.
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鼠外周血中转基因胎儿细胞的检测及意义
目的探讨仔鼠出生前后小鼠胎儿细胞在母鼠体内存在的情况,为应用循环于母血中的胎儿细胞进行基因诊断提供科学依据.方法将非转基因的正常母鼠和以HS2、HS3元件、β-珠蛋白基因启动子指导的红系特异表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的转基因公鼠交配,仔鼠出生前后采集母鼠的外周血用流式细胞仪检测其中表达GFP细胞的比例,并用PCR对母鼠和仔鼠的鼠尾DNA及母鼠的外周血进行检测.结果在仔鼠出生前母体外周血中未检出表达GFP的细胞,而分娩后1~3周此类细胞含量达到峰值,4~5周后将逐步消失.PCR检测证实母鼠体内没有外源GFP基因的DNA片断,但分娩后其外周血中则存在GFP 基因阳性片断,这与荧光激活细胞分选仪(FACS)的检测结果一致.结论转基因细胞是一种良好的标记物,可以用来观察胎儿细胞在母体中存在的规律,为使用母体外周血进行基因诊断提供了依据.
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孕母血中抗胎儿细胞IgG类抗体酶联免疫检测法的建立
人绒毛滋养细胞表面存在特异性胎儿细胞抗原位点,针对这些抗原位点的免疫应答,有可能诱发原因不明性流产等病理性妊娠的出现.然而,由于缺乏相应的检测手段,国内外尚无有效、特异的免疫性流产诊断方法.因此,我们利用纯化的滋养细胞表面抗原,建立了孕母血中抗胎儿细胞IgG类抗体的酶联免疫法(ELISA)测定,用于免疫性流产的特异性诊断.
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从孕妇外周血富集胎儿细胞技术的进展
目前,应用胎儿细胞进行产前基因诊断的主要方法有羊膜腔穿刺、绒毛活检和脐静脉穿刺术.这些有创性检查导致的孕妇流产率均为1%左右,且与操作者技能密切相关.虽然可结合孕龄、血清生化及超声技术等指标进行产前筛查(阳性预测值2.3%),有选择性的进行上述产前检查,仍造成许多健康胎儿的夭折,对孕妇和家庭造成严重不良影响.
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母体外周血中的胎儿细胞在产前诊断中的应用
通过检测母血循环中的胎儿细胞产前诊断胎儿基因和染色体异常具有重要的临床价值.自上世纪90年代以来,胎儿细胞的富集技术和高灵敏度的单细胞分析技术取得了重大进展.目前胎儿细胞的富集主要利用抗转铁蛋白受体抗体和抗血红蛋白抗体进行荧光激活的细胞分选或磁珠细胞分选.另外,还有基于植物血凝素的方法和自显影分析分选富集胎儿细胞.富集到的胎儿细胞可用于荧光原位杂交技术、定量荧光聚合酶链反应、引物原位标记等分析.本文重点讨论胎儿细胞富集方法的进展及存在的问题.
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基于胎儿细胞的无创产前检测技术研究进展
经过近半世纪的探索研究,基于母体内胎儿细胞的产前检测技术随着新技术的开发和利用,尤其在单细胞测序技术长足发展这一背景下,正在逐步走向临床.在此我们回顾这类研究的新进展,讨论此类技术的突破对将来的产前诊断技术策略的影响.
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无创性产前诊断:从梦想到现实
无创性产前诊断(non-invasive prenatal diagnosis,NIPD)是一个长期追求的目标.几十年来,研究人员一直在努力寻找有效方法,去分离、纯化,并识别存在于母体循环中的少量胎儿细胞,胎儿细胞浓度约为每毫升母血中1~6个[1].
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非侵入性产前诊断研究及临床应用新进展
由于环境情况不良、生育年龄延迟,出生缺陷的发病率在升高.非侵人性产前诊断是研究热点.通过分离母体血中胎儿细胞、经宫颈收集胎儿细胞,由母体血清中提取胎儿游离DNA及mRNA可对染色体异常疾病、基因异常疾病及RhD血型进行的产前诊断称之为非侵入性产前诊断(non- invasive prenatal diagnosis,因该检查手段并非完全无创,故认为非侵入性产前诊断更为合适)[1].多认为非侵人性产前诊断可以早期对胎儿异常做出较为安全有效的诊断,有利于降低出生缺陷.
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非侵入性产前筛查
围产期出生缺陷与死亡一直是世界范围待解决的难题。在发达国家和中国内地的围产儿死亡原因中,严重的出生缺陷仍占据第一及第二位,因此,预防和减少出生缺陷是降低围产儿死亡率的主要途径之一。目前,在临床上产科医生较为广泛用于检查、诊断及监测胎儿在母体宫内发育的工具是经腹及阴道超声扫描[1-6]。由于现代科技的发展,用于产前检查及产前诊断的超声仪发展日臻完善。自20世纪80年代初至今,由于人们对超声检查的认识及认可,对于超声检查是否会对人类胚胎造成畸形的研究日益增多,虽然部分学者仍持谨慎态度,但大多亦认为其安全性和准确性较高。其中一些国家,如英国及澳大利亚等,近90%~100%的孕妇在妊娠期接受至少1次的超声检查,而大多数欧美国家及现时中国大部分南方城?均把产前超声视为产前常规检查项目之一[2-3]。国家卫生部2003年5月1日颁布实施了《产前诊断技术管理办法》,建议在整个妊娠期中常规进行3次超声检查,时间分别为孕11~13+6周[测量胎儿颈部透明层(nuchal translucency,NT)和筛查唐氏综合征]、孕19~22周[系统筛查胎儿畸形(金标准)]及孕29~32周[7]。此外,作为胎儿宫内诊断的方法目前有侵入性和非侵入性两大类。随着分子生物学技术和医学遗传学的发展,产前诊断技术不断朝早期、快速、准确及无创的方向发展,使越来越多的出生缺陷能够在胚胎发育的较早期被安全及准确地诊断出来。其中非侵入性技术主要包括经宫颈脱落滋养细胞、孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿游离 DNA 的检测等[5-7]。
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应用转铁蛋白受体和胎儿血红蛋白标记染色方法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究
由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少,Hahn, Holzgreve[1]和Bianchi等[2]报道,孕妇每毫升外周血中仅有1~2个完整胎儿细胞.所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记,并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术,是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的佳手段[3].但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体,故不同学者选用的标记性抗体也有所不同.本研究采用荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS ),通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体(transferrin receptor, CD71)单标记染色和胎儿血红蛋白(fetal haemoglobin,HbF)单标记染色与双标记染色情况的比较,探讨CD71 与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值.
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检测孕妇血循环中胎儿DNA进行无创产前诊断的研究进展
孕妇血循环中胎儿DNA以两种形式存在,一是存在于进入母体血循环中的胎儿的完整细胞内,二是游离于母体血浆中.分析孕妇外周血循环中完整胎儿细胞DNA或游离DNA,是无创性产前诊断领域的一个日益引人注目的技术,这一技术可以单独使用或与其他无创性检查方法,如超声诊断、孕妇血清学分析等联合应用,使无创性产前诊断技术提高到一个新的水平.近年采用先进的磁珠细胞分选法(magnetic cell sorting, MACS)、流式细胞分选术和激光捕获显微分离(laser capture microdissection, LCM)技术富集分离胎儿细胞,发现孕妇血中存在较丰富的胎儿游离DNA,只要利用足够敏感的方法,就能对胎儿性连锁疾病和其他一些遗传性疾病进行无创早期诊断.本文就母血中胎儿DNA的存在形式、分析方法以及临床应用的进展情况综述如下.
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孕妇血浆中游离胎儿DNA测定在产前诊断中的应用
传统的羊膜腔穿刺和绒毛吸取是目前许多医院较为常用的产前诊断技术,因其操作易导致流产、胎儿损伤或死亡、宫内感染、羊膜破裂等,使其在临床上的推广和应用受到了限制.利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行遗传学诊断一直是无创性产前诊断的重要探索途径[1].但由于孕妇外周血中的胎儿细胞数量少,而且存在个体差异,目前很难从外周血中分离出完整的胎儿细胞,这无疑限制了这种方法在临床上的应用[2].1997年,有学者研究发现,孕妇血液循环中存在较丰富的游离胎儿DNA,这一发现为无创性产前诊断和筛查开辟了新领域[2,3].
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母-胎界面滋养细胞生物学特性及功能调控
滋养细胞携带来自胎儿的外胚层抗原,是母-胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞,在母-胎免疫耐受中发挥重要作用.许多产科疾病,如反复自然流产、妊娠高血压综合征(妊高征)及胎儿生长受限[FGR,原名宫内生长迟缓(IUGR)[1]]等,均伴有滋养细胞某些生物学功能的异常.对滋养细胞与母体免疫关系的研究一直是生殖免疫学的热点.以下对滋养细胞的生物学特性及功能调控作一综述.
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胎儿细胞父源性人类白细胞抗原DQA基因检测
随着应用孕妇外周血中胎儿细胞进行无创性产前诊断研究的进展,多数研究者利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)或荧光原位杂交的方法检测性别决定基因(sex-determining region Y,SRY)[1-3],作为鉴定胎儿细胞存在或已成功分离的手段,但这些方法仅局限于检测妊娠男性胎儿的孕妇外周血中的胎儿细胞.人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DQA基因属于HLA-Ⅱ类抗原[1],该基因的多态性和高变异性使HLA-DQA基因位点具有较好的鉴别力[2].我们应用PCR-反向点杂交法,检测孕妇外周血中胎儿细胞父源性HLA-DQA基因,旨在推动无创性产前基因诊断的基础研究.
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套管拭子获取胎儿合体滋养细胞在产前诊断中的应用
产前诊断已从侵入性技术逐渐向非侵入性技术过渡.经孕妇生殖道采集胎儿细胞,正以其取材简便、容易获取胎儿细胞及费用低这一优势吸引着众多的研究者.如何提高胎儿细胞获取率,如何克服来自精液污染等干扰因素,又是该领域中出现的新问题.本研究通过使用自行设计的套管拭子,选择子宫下段作为取样部位,与普通拭子法进行比较性研究,探讨解决上述问题的新途径.