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彗星试验银染法的筛选
彗星试验(Clmet Assay)因众多优点已被广泛应用于各种研究领域,但常规使用荧光染色观察结果,在很大程度上限制了其推广应用.为了建立一种染色效果好,能取代EB染色的非荧光染色法,本实验室已将4种非荧光染色法试用于彗星试验,发现只有银染法可以染色彗星细胞,且染色持久[1].
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彗星试验银染法的优化及验证
在彗星试验中寻找一种佳染色效果的银染法,拟取代溴化乙啶(EB)染色.对选出的银染法从固定、染色、显色、脱色、染色温度等各个方面进行多次试验,达到佳染色效果后,将优化的银染法用于检测两类化合物-重铬酸钾(K2Cr2O7)和1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane, DCE)对两种类型细胞-小鼠脾细胞、人外周血淋巴细胞的DNA损伤作用,并与EB染色比较灵敏度.结果显示优化后的银染法是在彗星试验中成功建立的非荧光染色法,该法染色清晰、持久、背景颜色浅、染色对比度好、染色效果满意,方法操作简便、价廉;该法可检测出化合物对细胞的DNA损伤作用,与EB染色有相同阳性检出阈,可染出EB染色无法染上的DNA小片段.所以在彗星试验中该银染法可以取代EB染色.
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改良银染法在病理诊断中的应用
银染法作为传统的特殊染色方法仍然是显示病原体、组织及细胞内特殊结构的简便而可靠的方法之一,其原理是利用生物组织成分对银离子还原性质的不同,显示组织及其中微生物的形态.
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凝胶上蛋白质染色方法研究进展
凝胶电泳是分离蛋白质及多肽的一种强有力的生化分析工具.而蛋白质染色在凝胶电泳系统中则是一个重要的组成部分,随着蛋白质组学的飞速发展,凝胶蛋白质染色技术已成为衔接二维电泳和下游质谱分析的关键环节.目前,常用的凝胶上蛋白质染色方法主要有染料染色法、银染法、负染法和荧光染色法.本文对近几十年来在凝胶上蛋白质染色技术方面所取得的进展和突破进行总结,并对未来的发展方向做出展望.
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不同银染法和上样模式对双向凝胶电泳影响的初步分析
双向凝胶电泳(2-DE)技术是蛋白质组学研究的重要支撑技术之一.该技术利用蛋白质2项独立物化参数--等电点(pI)和分子量的差异,将高分辨率的等电聚焦电泳(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)程序相组合.2-DE常用的标本上样方式有溶涨上样和杯上样.前者溶涨与等电聚焦同时进行,后者溶涨与等电聚焦依次进行.常用的下游蛋白质显示技术包括同位素标记法、荧光标记法、染料标记法、金属和重金属离子标记法.银染法属金属离子还原染色,分双胺银染法和非双胺化学显色银染法.本研究通过比较两种上样方式和两种银染法对人肝癌细胞系MHCC97H、97L的2-DE图谱的影响,以期建立较理想的实验室内2-DE相关技术的方法.
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结核性腹膜炎与恶性腹水端粒酶活性
目的:研究端粒酶在结核性腹膜炎腹水与恶性腹水的活性水平,探讨腹水端粒酶检测鉴别结核性腹水与恶性腹水的诊断价值.方法:应用TRAP-PCR-ELISA方法和TRAP-PCR-银染法分别对13例结核性腹膜炎和18例恶性腹水标本(肝癌7例,胃癌6例,结肠癌2例,胰腺癌1例,卵巢癌2例)进行定性、定量端粒酶活性检测.对比腹水细胞学检查,分析腹水端粒酶活性鉴别结核性腹膜炎与恶性腹水的诊断价值.结果:恶性腹水组端粒酶活性(0.387±0.023)高于结核性腹膜炎腹水组(0.023±0.004),统计差异显著(P<0.01);恶性腹水端粒酶阳性率88.9%(16/18)明显高于结核性腹膜炎腹水组7.7%(1/13),P<0.01.仅1例结核性腹膜炎腹水端粒酶阳性.结论:恶性腹水端粒酶阳性,结核性腹水端粒酶阴性.腹水端粒酶活性检测可能是鉴别结核性与恶性腹水的重要依据.
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胃癌SMAD4/DPC4杂合性丢失的研究
目的:探讨胃癌中SMAD4/DPC4杂合性丢失(loss ofheterozygosity,LOH)与胃癌临床病理的关系.方法:用多聚酶链反应-单链构相多态性(PCR-SSCP)银染法分析50例原发性胃癌SMAD4/DPC4的杂合性丢失.结果:D18S46 LOH为36.2%(17/47),D18S474 LOH为39.1%(18/46),DPC4LOH为59.2%(29/49).SMAD4/DPC4LOH的发生率随着胃壁浸润深度的加深而增高,随着TNM分期的增加而增高(P<0.05).胃癌直径≥5 cm时,SMAD4/DPC4 LOH要明显高于胃癌<5 cm时(P<0.05).SMAD4/DPC4 LOH在Borrmann分型中有显著性差异(P<0.05).结论:SMAD4/DPC4的杂合性丢失可能在胃癌的发展中起重要作用,是胃癌发展后期的重要分子事件.
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系统性红斑狼疮患者淋巴细胞增殖活性分析
目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单核细胞(PBMC)中T细胞仁嗜银蛋白(AgNORs)和T细胞亚群及辅助性T细胞亚群(Th)的关系及其临床意义,指导临床诊断与治疗.方法PBMC经多克隆T细胞活化剂刺激,以图像分析法检测AgNORs区面积与细胞核仁面积的百分比(I.S%);以微量细胞毒法检测T淋巴细胞亚群水平;以ELISA法检测血清中干扰素(IEN)-γ、白细胞介素(IL)-4水平来评价辅助性T细胞亚群活性.结果①13例稳定期和17例活动期SLE患者PBMC中活化T细胞AgNORs表达分别为(5.14±1.06)I.S%和(3.21±1.40)I.S%,与正常对照组(6.69±1.30)I.S%相比,均显著下降(P<0.05,P<0.01);活动期显著高于稳定期(P<0.01);②与稳定组和正常对照组相比,活动期SLE患者CD4-T细胞计数(23.5±7.8%)和CD4/CD8比值(0.58±0.31)显著降低(P<0.01),CD8计灵敏(37.4±12.1%)明显升高(P<0.05);③与稳定组和正常对照组相比,活动期SLE患者血清IL-4(37.2±2.7pg/ml)水平明显升高(P<0.05),IFN-γ(17.9±2.7pg/ml)分泌较正常对照组明显降低(P<0.05),与稳定期患者无显著差异(P>0.05).结论①SLE患者细胞免疫活性低于正常水平;②活动期患者血清IL-4分泌水平增高,INF-γ水平降低,提示Th1类活性降低,在SLE中存在Th1/Th2的不平衡.
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幽门螺杆菌银盐染色方法改进
慢性浅表性胃炎、消化性溃疡以及胃癌与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的感染关系密切[1].因胃镜活检标本病理诊断的需要,本科实验室自1988年以来开展Hp银盐染色技术.我们以Warthin-Starry银染法为基础加以改进,现报道如下.
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改良三重染色法在幽门螺杆菌检测中的应用
幽门螺杆菌是存在于胃幽门等部位的一种革兰阴性杆菌.其形态特点是短杆状、两端微弯,与慢性胃炎和消化性溃疡以及胃癌的发生有关.目前,对幽门螺杆菌的染色多选用Warthin-starry银染法[1],但该法存在着配制染液的方法较烦琐,染色过程中需在水浴箱中孵育,导致染色时间较长等缺点.改良三重染色法[2](苯酚品红/阿辛蓝/苏木素-伊红)有着价格低廉,试剂配制简单,操作简便,诊断迅速等特点.它可以在自动染色机上完成染色的全过程,并且在一张染色切片中既可看到HE的染色效果,又能观察到幽门螺杆菌的感染程度以及肠上皮化生等病理改变.而且,该种染色方法在一般实验室即可开展.
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人脑肿瘤端粒酶活性表达及其临床意义
目的研究人类脑肿瘤中端粒酶的表达情况,探讨端粒酶活性与恶性脑肿瘤发生和发展的关系.方法采用TRAP-银染法检测37例脑肿瘤组织和4例正常脑组织中的端粒酶活性.结果37例脑肿瘤组织标本中,16例有端粒酶活性的表达,阳性率为43.2%;4例正常脑组织中均未检测到端粒酶活性.结论端粒酶活性的表达与脑肿瘤的恶性程度密切相关,有可能成为恶性脑肿瘤的一个重要标志物.
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中药白头翁对体外大肠杆菌生物膜抑制作用研究
目的:在Φ30培养皿和96孔板表面建立大肠杆菌生物被膜(E.coli biofilm,EBF),形成体外模型,并开展白头翁对EBF抑制作用的初步研究。方法选取临床分离的大肠杆菌菌株,在Φ30培养皿和96孔板中分别复制体外EBF模型,将白头翁作用于EBF体外模型,分别采用银染法和MTT法考察白头翁对EBF的影响。结果Φ30培养皿中,表面观察到黑色呈棉絮状的膜样物,空白组没有此样物质;96孔板中,模型组的OD值为0.079,空白组的OD值为1.548;白头翁醇提组抑制率为25.79%,白头翁水提组抑制率为53.11%;750μg/mL的白头翁对大肠杆菌生物被膜有佳抑制作用,抑制率为55.17%;药物作用12h后开始白头翁组的EBF明显少于空白对照组,24h效果好。结论Φ30培养皿和96孔板表面可以形成大肠杆菌生物被膜体外模型,白头翁可以抑制和破坏早期及成熟的细菌生物膜,且其抑制作用表现出了一定的量效关系。
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彗星试验非荧光染色研究
目的为了建立一种非荧光染色的彗星试验.方法将Feulgen法、甲基绿染色法、全染料(stains-all)法和银染法等几种非荧光DNA特异染色方法试用于彗星试验,并与溴化乙锭(EB)染色进行了比较.结果在所试验的染色法中,仅银染法有满意的效果,染色清晰,"彗星"头和尾的边界易于判断,染色持久,敏感性高,可染出EB不能染出的DNA小片段,得到"彗星"头长和尾长均为EB染色的2倍以上,安全、价廉.结论银染法摒弃了EB染色的不足,在彗星试验中可以替代EB染色,为彗星试验的进一步推广提供了可能.
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选择性IgA缺乏症患者细胞免疫活性分析
目的探讨选择性IgA缺乏症(Selective IgA Deficiency,SIgAD)患者的细胞免疫功能,指导临床诊断与治疗.方法以激光比浊法测定患者血清IgG、IgA、IgM水平,以银染法检测外周血T淋巴细胞增殖活性,以单抗花环法检测T淋巴细胞亚群水平,以ELISA法检测血清中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平来评价辅助性T细胞亚群活性.结果①22例IgA水平低于0.1g/L而IgG、IgM基本正常的患者,CD3、CD4、CD8计数与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),CD4/CD8比值显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);②T淋巴细胞增殖活性(I.S%)为(4.75±1.17)%,与对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);③SIgAD患者血清IL-4水平与正常对照组比较显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),IFN-γ分泌无明显变化.结论①选择性IgA缺乏症患者细胞免疫活性低于正常水平;②IL-4分泌水平降低,提示Th2类活性降低,在选择性IgA缺乏相关疾病中存在Th1/Th2的不平衡.
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银染法鉴定克雷伯杆菌生物被膜
目的探讨银染法鉴定克雷伯杆菌生物被膜的可靠性.方法采用改进的平板培养法建立克雷伯杆菌生物被膜,用银染法和扫描电镜进行观察鉴定.结果银染后普通光学显微镜观察和扫描电镜观察对生物被膜的鉴定符合率是100%.结论用银染法鉴定克雷伯杆菌生物膜方法可靠、简单.
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银染法鉴定细菌生物被膜
细菌生物被膜的主要成分是多糖蛋白复合物,Costerton等人[1]在70年代通过扫描电镜观察到了细菌生物被膜的存在,但是通过钌红等染色后进行电镜观察,操作复杂,周期长,不易推广.近年来,临床微生物学研究工作者开始探索采用染料对细菌胞外糖进行染色,观察细菌生物被膜[2].本实验是通过银染色的方法鉴定细菌生物被膜的存在,该方法简单、可靠,现将报道如下.
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银染法观察葡萄球菌生物被膜
[目的]探讨银染法观察葡萄球菌生物被膜方法的可靠性. [方法]建立细菌生物被膜,分别用银染法和扫描电镜进行观察.[结果]银染后普通光学显微镜观察和扫描电镜观察生物被膜的结果完全相符.[结论]用银染法观察细菌生物被膜的变化方便、可靠.
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不同组织细胞中端粒酶活性的表达及其意义
端粒酶在人类细胞永生和致癌的过程中起着至关重要的作用.自1998年起,我们采用TRAP-酶联法及TRAP-银染法对259例不同的临床标本进行了端粒酶活性的定性定量检测,以探讨端粒酶的活性与不同的组织细胞恶性程度的关系及端粒酶能否作为一个肿瘤标志物广泛应用于临床诊断中.
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PCR-SSCP法检测耐多药结核分支杆菌耐药性
我国是结核病疫情严重的国家之一,其主要原因是耐药和耐多药结核病的广泛分布和迅速传播.异烟肼(INH)和利福平(RFP)均是抗结核的一线药物,对于其作用机理及结核杆菌的耐药机制的研究日益受到重视.据报道认为结核分支杆菌耐与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rpoB的突变有关;耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关,也inhA基因突变也有相关性[1,2].我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变,现将结果报告如下.
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整块组织Grimelius银染法显示胃肠内分泌细胞
普通Grimelius银染法显示胃肠内分泌细胞,其步骤是:Buoin液固定→用蒸馏水冲冼→脱水→透明→浸蜡→包埋→贴片→脱腊→复水→银染→还原→脱水→透明→中性树胶封片等.此方法存在→定的弊端:(1)实验步骤繁琐,不易掌握;(2)需染色缸比较多,并且经过脱水→复水→脱水复杂过程;(3)每个染缸中只能染有限的几张切片.由于普通Grimelius银染法存在以上缺点,所以,我们在几年的Grimelius银染法切片标本制作过程中进行了一些大胆的改革.HE染色法可以整块染色,而Grimelius银染是否也能进行整块染色,经过几年的摸索,认为是可行的.此方法简单、可靠,易于掌握,染色效果比较好.