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蛋白质组学技术及其在毒理学应用的研究进展
随着人类基因组序列草图的完成,生命科学研究已进入了后基因组时代,包括结构基因组研究和蛋白质组学研究等.随着近年来蛋白质研究技术的突破,蛋白质组研究不仅已成为生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,而且也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一.
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脑泰方血清和血浆蛋白质（肽）组学比较研究
目的：通过对脑泰方含药血清和含药血浆蛋白质（肽）组学的比较研究，发现脑泰方含药血清和含药血浆中的差异蛋白（肽）；以质谱分析技术确定差异蛋白的特征。从而为探索脑泰方的药效物质基础和发展中药血浆药理学方法提供科学依据。方法：取健康成年SD大鼠20只，按体重随机分为空白组、脑泰方给药组，每组10只，连续灌胃给药7天。手术前12 h禁食不禁水，末次给药后1 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉，经颈总动脉插管取血。每只大鼠采血后分别制备血清和血浆。每组随机抽取5只大鼠的血清及血浆，采用2-DE技术进行蛋白质（肽）组学比较研究,运用300DPI扫描、PDQuest 7.3.0软件进行分析；采用ESI-MS/MS对重要差异蛋白质点进行鉴定，筛选脑泰方血清和血浆差异蛋白的特征。结果：共获得20张胶图，各胶图分别得到664个蛋白位点。其中与空白血浆组比较，脑泰方血浆样品中共识别到20个差异蛋白点，其中15个差异点表达上调，5个差异点表达下调；与空白血清组比较，脑泰方血清样品中共识别到19个差异蛋白点，其中15个差异点表达上调，4个差异点表达下调；与脑泰方血浆组比较，脑泰方血清样品中共识别到24个差异蛋白点，其中9个差异点表达上调，15个差异点表达下调。选取在脑泰方血浆组和脑泰方血清组中高表达的10个差异蛋白质点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MAL-DI-TOF-MS），成功鉴定了6个蛋白，分别是：inter-alpha trypsin inhibitor, heavy chain 3、Group specific component、complement factor B、Receptor Complexed With A Heterodimeric Fc、complement factor B, isoform CRA-d、Transferrin。结论：脑泰方含药血浆、血清中明显变化的蛋白质可能与其抗凝血促纤溶作用机制相关，这些蛋白参与血管新生、炎症调控等病理生理过程，对研究脑泰方作用的可能有效靶点及其信号转导通路意义重大。
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特发性男性不育患者精浆蛋白质分析
目的 寻找诊断特发性男性不育的生物标记分子.方法 应用二维电泳与质谱技术(MS+MS/MS)分析特发性男性不育患者与正常对照组精浆蛋白质组成,寻找差异表达蛋白质.结果 特发性男性不育患者较正常对照组精浆中血清白蛋白和前列腺酸性磷酸酶减少,而组织蛋白酶B和锌α2糖蛋白增加.结论 特发性男性不育可能与精子获能受阻及精液免疫功能紊乱有关.
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癌蛋白质组学技术及其应用
蛋白质组学的研究由二维电泳的引进揭开序幕,而近年来质谱技术和蛋白质芯片的广泛引入使得蛋白质组学技术得到越来越多的应用,尤其是应用在肿瘤研究中.癌蛋白质组学以整个肿瘤特异性蛋白信号网络为靶标,已应用到多种癌症的研究中,成为肿瘤研究的重要工具.本文将对癌蛋白质组学技术原理以及近年来在肿瘤研究中的应用加以综述.
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二维电泳和质谱技术鉴定肝细胞癌相关N-连接糖蛋白
目的 鉴定与肝细胞癌(HCC)发生发展相关的差异表达N-连接糖蛋白.方法 采用刀豆凝集素A(ConA)、晶状体凝集素(LCH)、雪花凝集素(GNA)等3种植物凝集素组成的亲和层析柱,分别从肝永生化细胞系L02和HCC细胞系Huh7、PLC5、SNU449中纯化N-连接糖蛋白、二维电泳分析差异表达的蛋白质斑点,质谱、生物信息学等技术鉴定差异表达蛋白,Western blotting验证了转录调控肿瘤蛋白(TCTP)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)和膜联蛋白A2(annexin A2)在肝永生化及HCC细胞和HCC及癌旁组织中的表达规律,体外侵袭实验检测TCTP沉默后对SNU449的侵袭力影响.结果 质谱、生物信息学等技术共鉴定出42个差异表达的蛋白质分子/异质体(HCC细胞中高、低表达的蛋白/异质体分别为14个、28个),代表32个蛋白质分子,其中的22个蛋白含有至少1个N糖基化位点(NetNGlyc l.0预测).这些差异表达的蛋白主要参与氧化还原内稳态维系、碳水化合物/能量代谢、糖酵解、抗凋亡等生物学过程.Western blotting检测表明,TCTP、EpCAM和annexin A2在6个肝癌细胞系PLC5、HepG2、SNU449、Huh7、HCC7721和SNU473及肝癌组织中表达显著升高,siRNA介导的TCTP沉默明显抑制了HCC细胞系SNU449的体外侵袭能力.结论 TCTP、EpCAM和annexin可能参与了HCC发生发展过程,TCTP可能成为HCC靶向治疗的分子靶点之一.
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肝细胞癌中差异表达 N-连接糖蛋白的分析鉴定
目的：分析鉴定与肝细胞癌（ HCC）发生发展相关的差异表达的N-连接糖蛋白。方法应用刀豆蛋白凝集素（ConA）、晶状体凝集素（LCH）和雪花凝集素（GNA）组成的亲合层析柱富集10对HCC和癌旁非癌组织中N-连接糖蛋白、二维电泳（2DE）比较分析差异表达的蛋白质点、串联质谱鉴定差异表达蛋白，Western blotting 验证人羧酸酯酶1（hCE1）、触珠蛋白（HP）及组织蛋白酶D（CD）的差异表达；体外侵袭实验检测CD表达沉默后对HCC的侵袭力影响。结果质谱、生物信息学等技术鉴定了28个与HCC相关的差异表达蛋白（ HCC中高表达和低表达的蛋白均为14个），Western blotting验证hCE1、HP在HCC中明显低表达，组织蛋白酶D前体（ pCD）在HCC中高表达；而ConA亲和层析柱富集的ConA-CD在HCC中显著高表达。 CD-siRNA介导的CD表达沉默能够显著降低肝癌细胞系SNU449、SNU473的体外侵袭能力。结论 HP、hCE1蛋白表达变化和CD N-糖链变异可能参与了HCC发生发展过程。
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凝胶电泳蛋白质组学蛋白样品纯化方法比较
目的 探讨超滤法和7种不同沉淀方法纯化含PBS的蛋白样品对蛋白凝胶电泳的影响.方法 应用超滤法和7种沉淀方法[包括硫酸铵、氯仿甲醇、酸化丙酮甲醇、乙醇、丙酮、三氯乙酸(TCA)、TCA/丙酮]纯化PBS稀释的混合食管癌组织蛋白(10例),二喹啉甲酸(BCA)、Bradford及2D法测定蛋白浓度并进行一维和二维聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,Image Master软件分析二维电泳图谱蛋白点.结果 Bradford法和2D法适用于二维电泳水化液溶解的蛋白样品浓度测定.超滤法和硫酸铵沉淀法的蛋白回收率分别为40％和4％,其他方法的蛋白回收率约为22％.丙酮沉淀法纯化蛋白的二维电泳图谱蛋白点边界清晰、分辨率高且数目多;其次是乙醇沉淀和氯仿甲醇沉淀法;再其次是超滤法,该法纯化蛋白的二维电泳图谱蛋白点表现不同程度的弥散;酸化丙酮甲醇沉淀蛋白的二维电泳图谱中蛋白点丢失多.结论 丙酮沉淀法适用于原始浓度高、体积小的蛋白样品除盐及浓缩,超滤法是原始体积较大、浓度较低蛋白样品浓缩纯化的首选方法.
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蛋白质组中蛋白质磷酸化研究进展
随着后基因组时代的到来,对生命体器官、组织或细胞的全部蛋白质的表达、修饰及相互作用的研究已成为蛋白质组学的重要任务.蛋白质磷酸化是细胞内信号转导和酶调控常见的机制之一,人类基因组约2%的基因编码500种激酶和100种磷酸酶.蛋白质磷酸化和去磷酸化作为原核和真核细胞表达调控的关键环节,了解其对功能的影响可以深入理解生命系统在分子水平的调控状况.目前蛋白质组磷酸化研究仍是功能基因组面临的重大课题,本文对此作一综述.
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大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定
目的 筛选并鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴的相关蛋白,为进一步的功能研究和蚊先天性免疫研究奠定基础.方法 以大劣按蚊- 约氏疟原虫为实验模型,利用二维电泳技术分离和比较饱吸约氏疟原虫感染的鼠血和正常鼠血后24 h 的大劣按蚊血淋巴蛋白,获得差异蛋白,并对差异蛋白进行N端氨基酸测序和生物信息学分析,从而推测差异蛋白的功能.结果 获得清晰二维电泳图,并筛选获得37个差异蛋白点.对其中比较明显的差异蛋白1进行氨基酸测序后发现,该蛋白可能为一翻译延伸因子.结论 成功分离和筛选获得了大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白,并进行了初步鉴定.
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约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳-质谱分析
目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白,找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白.方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白,考马斯亮蓝染色,BIO-RAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱,用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库.结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱.凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点,感染蚊中肠有158个蛋白点,相同有107个,pI偏酸性.未感染蚊唾液腺有178个蛋白点,感染蚊唾液腺有201个蛋白点,相同有167个,pI分布较均匀.选择7个差异蛋白点进行分析,得到了6个蛋白肽质指纹图谱,查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个,另1个来源于蚊组织.疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等.结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法,并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白,部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关.
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人APL细胞株NB4不同二维电泳条件对电泳结果的影响
本研究探讨不同二维电泳条件对人急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4二维电泳结果的影响.选用24 cm,pH3-10L的固定pH梯度(immobilized pHgradient,IPG)胶条,用IPGphor进行第一相等电聚焦,然后用Ettan Dalt Ⅱ垂直电泳系统进行第二相SDS-PAGE,银染后用ImageMaster 2D Elite软件进行分析.结果表明:采用低离子强度的缓冲液冲洗收集样品可以提高等电聚焦效果.裂解液中7 mol/L尿素、40 mmol/L DTT能溶解NB4细胞大部分蛋白质,而水化液中硫脲与尿素合用可以明显增加碱性端中低分子量区可分辨的蛋白质点.NB4细胞用24 cm,pH3-10L的IPG胶条进行二维电泳时,100μg左右的上样量、63 200V小时左右的等电聚焦时间是恰当的.结论:APL细胞的蛋白质种类繁多,受多种因素影响,正确选择样品制备方法和二维电泳条件十分重要.
关键词： 急性早幼粒细胞白血病 蛋白质组 NB4细胞株 二维电泳 IPG -
凝胶上蛋白质染色方法研究进展
凝胶电泳是分离蛋白质及多肽的一种强有力的生化分析工具.而蛋白质染色在凝胶电泳系统中则是一个重要的组成部分,随着蛋白质组学的飞速发展,凝胶蛋白质染色技术已成为衔接二维电泳和下游质谱分析的关键环节.目前,常用的凝胶上蛋白质染色方法主要有染料染色法、银染法、负染法和荧光染色法.本文对近几十年来在凝胶上蛋白质染色技术方面所取得的进展和突破进行总结,并对未来的发展方向做出展望.
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幽门螺杆菌动物模型驯化菌株SS1与其初始菌株的差异蛋白质组分析
目的: 比较H pylori动物模型适应菌株SS1与其初发菌株10700间蛋白质组差异, 试图获得H pylori在小鼠体内适应过程中可能与定植能力增强相关的蛋白特征.方法: 在相同件下培养SS1菌株及其初始菌株, 并制备全菌蛋白样品, 相同实验条件下重复3次, 样品经二维电泳分离, 扫描获得数字化的电泳胶图像并用ImageMaster2D图像分析软件比较分析, 识别SS1与初始菌株间的差异蛋白点. 取3次制备的样品间的共同差异点进行胶内酶解, 经基质辅助激光电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)获得肽质量指纹图谱, 用Mascot软件在Swiss-Prot和NCBI数据库中搜索匹配蛋白.结果: 表达量有明显下降的11个点, 经鉴定对应10个蛋白: 4个属于H pylori的氧化还原系统, 即过氧化氢酶、超氧化物双歧酶、硫氧环蛋白和环氧蛋白还原酶;5个蛋白与代谢有关,即脯氨酸肽酶(proline peptidase)、果糖磷酸氢盐醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase)、无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase)、3-含氧酸辅酶A转移酶亚单位B(3-oxoacid CoAtransferasesubunit B)和延伸因子(elongationfactor P);另1个蛋白为假想蛋白HPAG0942.结论: H pylori在小鼠体内的定植适应过程中,伴有代谢酶表达的降低和抗氧化水平的减弱,提示代谢和抗氧化能力适度下调可能与菌株的定植力增强相关.
关键词： 幽门螺杆菌 动物模型 二维电泳 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 -
支气管哮喘蛋白质组学研究的现状和前景
蛋白质组学是后基因组时代一项重要的生命科学的研究手段,近年在支气管哮喘的发生、发展方面的研究方兴未艾.它主要依托质谱和二维电泳技术比较正常和病理状态下组织或细胞的差异蛋白质的表达,结合生物信息学的方法,从而研究疾病的发病机制及为临床提供诊断和治疗靶点.在哮喘的研究中目前主要是比较蛋白质组学的研究,发现新的靶标为临床服务同时探讨其发病机制.
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线粒体Prohibitin蛋白在紫杉醇耐药的CCRF-CEM细胞中表达的变化
目的:研究线粒体prohibitin蛋白在紫杉醇耐药的CCRF-CEM细胞中的表达变化,探讨线粒体prohibitin蛋白在CCRF-CEM肿瘤细胞耐药发生机制中的作用.方法:提取紫杉醇耐药的CCRF-CEM/taxol细胞的线粒体总蛋白,对经双向电泳分离后得到的SDS-PAGE胶用ImageMasterTM 2D Platinum software进行分析、比对,对胶上的蛋白点进行质谱分析,通过SWISS-PROT和NCBInr数据库鉴定蛋白的归属.结果:紫杉醇耐药的CCRF-CEM/taxol细胞中的线粒体prohibitin Protein15表达升高了68.6%(以蛋白表达的体积计).结论:紫杉醇耐药的CCRF-CEM/taxol细胞中线粒体prohibitin表达增加.prohibitin可能通过调节线粒体的活动,对抗紫杉醇诱导的细胞凋亡,在耐药机制中发挥重要作用.
关键词： 多药耐药 CCRF-CEM Prohibitin 线粒体蛋白质组 二维电泳 -
左肾动脉缩窄诱导心肌肥大大鼠心肌蛋白差异表达研究
目的:应用蛋白质组学方法分析病理性心肌肥大心肌细胞蛋白表达特征.方法:雄性SD大鼠16只,分为2组(n=8):两肾一夹组(2K1C)和假手术组(SO),术后饲养8周,使用普通多普勒和组织多普勒鉴定动物模型,然后提取心肌总蛋白,应用二维凝胶电泳技术,建立分辨率高和重复性良好的凝胶图像,质谱(MAIDI-TDF-MS)鉴定差异蛋白点,与网络数据库进行匹配,并对鉴定蛋白进行分类.结果:两肾一夹大鼠心肌细胞有21个蛋白点表现出显著增加或减少,经数据库匹配,获得14种差异表达的蛋白质.结论:两肾一夹大鼠心肌出现一些差异表达蛋白质,它们可能在病理性心肌肥大的发生中起重要作用.
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支气管哮喘蛋白质组学研究的现状和前景
蛋白质组学是后基因组时代一项重要的生命科学的研究手段,近年在支气管哮喘的发生、发展方面的研究方兴未艾.它主要依托质谱和二维电泳技术比较正常和病理状态下组织或细胞的差异蛋白质的表达,结合生物信息学的方法,从而研究疾病的发病机制及为临床提供诊断和治疗靶点.在哮喘的研究中目前主要是比较蛋白质组学的研究,发现新的靶标为临床服务同时探讨其发病机制.
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低转移性和高转移性的FBJ骨肉瘤细胞在脂筏上的区别
目的 通过寻找低转移性和高转移性的FBJ骨肉瘤细胞在脂筏上的区别来研究神经节苷脂(GD1a)调控肿瘤转移能力的机制.方法 提取细胞的脂筏成分,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和二维电泳来检测转移性不同的细胞在脂筏上的蛋白组成区别,并用免疫印迹法(Western blot)来分析转移性不同的细胞在脂筏上的磷酸化区别.结果 通过以上方法,发现了转移性不同的细胞在脂筏上的蛋白组成上有所不同,且磷酸化呈现明显区别,这些变化可能与调控肿瘤细胞的转移有关.
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蛋白质组学在脑脊液中的研究新进展
随着人类基因组草图绘制的完成和数十种生物全基因测序工作的结束,越来越多的学者发现基因数量的有限性和结构相对保守与生命复杂多变呈现出巨大反差.这种矛盾让人们想到要想研究生命活动,基因图谱完成是远远不够的,蛋白质作为生命体现者仍有重要的研究价值.一个以蛋白质组为焦点的生命科学时代已向我们走进.
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宫颈腺癌发生相关蛋白的蛋白质组学初步研究
目的:为了研究宫颈腺癌和正常宫颈组织的差异表达蛋白,为宫颈腺癌的发生和早期诊断提供有意义的生物标志物.方法:以正常宫颈组织和宫颈腺癌组织为研究对象,提取组织总蛋白,依次进行二维凝胶电泳,凝胶图象分析,基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质谱及生物信息学分析.Western Blot方法验证部分蛋白表达情况.结果:建立了宫颈腺癌和正常宫颈组织的二维电泳图谱,进行质谱和生物信息学分析比较鉴定宫颈腺癌和正常宫颈组织差异表达蛋白7个,与正常宫颈组织比较,宫颈腺癌表达降低的蛋白有3个,包括抑制素(inhibin-beta),PTEN,乳铁蛋白(lactoferrin);宫颈腺癌表达升高的蛋白有4个,包括谷胱甘肽S-转移酶(GSTT1*0),Homeodomain-interacting protein kinase 2(HIPK2),CD44v5,galectin-7.Western Blot方法检测结果显示inhibin-beta和PTEN在宫颈腺癌中表达变化情况与蛋白质组学结果一致.结论:宫颈腺癌和正常宫颈组织存在差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能是宫颈腺癌发生相关蛋白,可能作为宫颈腺癌早期诊断的标志物.
