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补骨脂素加长波紫外线诱导NB4细胞凋亡及对Fas/FasL基因表达影响的研究
目的 探讨自中药补骨脂中提取的补骨脂素(psoralen,PSO)加长波紫外线(ultraviolet A,UVA)诱导人白血病细胞NB4凋亡及对Fas/FasL基因表达的影响.方法 以NB4细胞为研究对象,采用流式细胞术、透射电镜、定量PCR等方法观察不同浓度的PSO,在不同时间的波长为360 nm的UVA照射下,细胞凋亡率、细胞超微结构以及细胞Fas/FasL基因、蛋白表达水平的变化.结果 (1)补骨脂素加长波紫外线(PUVA)可诱导NB4细胞凋亡,当PSO浓度为10、20、40、80μg/mL时,UVA照射5 min的细胞凋亡率分别为(26.57±0.42)%、(30.67±0.11)%、(34.90±0.30)%、(24.63±0.38)%,凋亡率呈剂量-时间依赖性,两因素间有交互作用.(2)电镜下观察经PUVA处理后的NB4细胞超微结构,可见明显的凋亡形态学改变特征.(3)PUVA可上调NB4细胞Fas基因、蛋白的表达水平,并呈剂量-时间依赖性,在基因水平两因素间有交互作用,在蛋白水平两因素无交互作用.(4)PUVA可下调NB4细胞FasL基因、蛋白的表达水平,并呈剂量-时间依赖性,且两因素间有交互作用.结论 PUVA可诱导白血病细胞NB4发生凋亡,Fas/FasL系统是PUVA诱导NB4细胞发生凋亡的作用途径之一.
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人APL细胞株NB4不同二维电泳条件对电泳结果的影响
本研究探讨不同二维电泳条件对人急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4二维电泳结果的影响.选用24 cm,pH3-10L的固定pH梯度(immobilized pHgradient,IPG)胶条,用IPGphor进行第一相等电聚焦,然后用Ettan Dalt Ⅱ垂直电泳系统进行第二相SDS-PAGE,银染后用ImageMaster 2D Elite软件进行分析.结果表明:采用低离子强度的缓冲液冲洗收集样品可以提高等电聚焦效果.裂解液中7 mol/L尿素、40 mmol/L DTT能溶解NB4细胞大部分蛋白质,而水化液中硫脲与尿素合用可以明显增加碱性端中低分子量区可分辨的蛋白质点.NB4细胞用24 cm,pH3-10L的IPG胶条进行二维电泳时,100μg左右的上样量、63 200V小时左右的等电聚焦时间是恰当的.结论:APL细胞的蛋白质种类繁多,受多种因素影响,正确选择样品制备方法和二维电泳条件十分重要.
关键词： 急性早幼粒细胞白血病 蛋白质组 NB4细胞株 二维电泳 IPG -
四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究
为了观察四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)对白血病细胞株NB4的增殖、分化和凋亡作用,并对其作用机制进行初步探讨.将不同浓度的ZGDHu-1与NB4细胞在体外培养,并以全反式维甲酸作阳性药物对照,观察ZGDHu-1对NB4细胞增殖抑制、凋亡和分化的作用.用流式细胞术检测ZGDHu-1诱导NB4细胞分化和调亡过程中bcl-2和bax的表达变化,以及P38MAPK和STAT3磷酸化水平,同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hTERT-mRNA表达的变化.结果表明:ZGDHu-1对NB4细胞增殖和活力抑制呈时间和剂量的量效关系,48和72小时的IC50分别为450和200 ng/ml.NB4细胞经ZGDHu-1作用后,大部分细胞阻滞于G2-M期,G0/1期细胞减少;细胞出现典型的形态改变,DNA片段化,亚G1峰检出并显著增加,Annexin-V/PI标记升高;Hoechst33258荧光染色后见凋亡细胞的特征性改变,这些均证实ZGDHu-1能诱导NB4细胞凋亡.NB4细胞经2-100ng/ml ZGDHu-1作用3天后,细胞部分分化,NBT阳性率增加,细胞表面CD11b、CD13表达增高.ZGDHu-1作用NB4细胞后,bc1-2表达无变化,但bax表达显著增加,bax/bcl-2的比值升高,磷酸化P38MAPK表达增强,而磷酸化STAT3表达无变化,端粒酶hTERT-mRNA的表达随ZGDHu-1作用的浓度增加而显著下调.结论:ZGDHu-1能抑制NB4细胞增殖,诱导细胞分化,促进细胞凋亡,其机制可能与bax表达上调、P38MAPK活化增强和端粒酶逆转录酶受抑有关.
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蛋白磷酸酶2A在三氧化二砷诱导NB4、MR2细胞株凋亡过程中的变化
本研究探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性与表达的变化.不同浓度ATO单用或与冈田酸(OKA)联合作用于NB4、MR2细胞,然后采用MTT法测定药物对细胞增殖的影响,用瑞氏染色法观察细胞形态学变化,流式细胞术测定细胞凋亡率,丝/苏氨酸磷酸化酶检测试剂盒分析药物对细胞内PP2A活性的影响,Western blot检测细胞内PP2A各亚基表达.结果表明:蛋白磷酸酶抑制剂OKA能明显增强ATO对NB4、MR2细胞的增殖抑制;OKA能促进ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡;ATO诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中PP2A活性均下降,且随ATO浓度的增加PP2A活性下降越明显;与OKA连用后PP2A活性下降更加明显;在ATO诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中,PP2A/A表达较对照组均明显减少,而B和C亚基表达与对照组比较变化不明显.结论:在ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡过程中,细胞内PP2A/A表达减少,PP2A活性降低,且随ATO浓度增加PP2A活性下降越明显,抑制PP2A活性有助于ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡.
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伊马替尼诱导早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡的实验研究
目的 观察伊马替尼(STI571)体外对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡的作用.方法 不同浓度STI571处理NB4细胞后,分别于不同时相:形态学观察凋亡小体的形成;MTT法检测NB4生长抑制率;用流式细胞仪检测在抗凋亡基因survivin和凋亡基因Smac的表达水平.结果 形态学观察到有典型的凋亡小体形成.MTF法检测结果 示:NB4生长抑制率上升.流式细胞仪检测结果 示:抗凋亡基因survivin的表达水平下降,凋亡基因Smac的表达水平上升,呈时间和剂量依赖性.结论 STI571有潜力诱导NB4细胞发生凋亡.
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VPA联合As2O3对NB4细胞VEGF及Survivin表达的影响
目的:探讨丙戊酸钠(VPA)联合三氧化二砷(As2O3)对NB4细胞株血管内皮生长因子(VEGF)、凋亡抑制蛋白Survivin表达的影响.方法:NB4细胞分为对照组、As2O3组及As2O3联合VPA组,RT-PCR方法检测NB4细胞VEGF、Survivin mRNA的表达.结果:As2O30.1μmol/L组NB4细胞VEGF mRNA的表达明显高于对照组、Survivin mRNA的表达明显低于对照组(P＜0.05);与As2O3 0.1 μmol/L组比较,As2O3 0.1 μmol/L+VPA 1.0mmol/L组NB4细胞VEGF mRNA、Survivin mRNA的表达均明显降低(P ＜0.05).结论:VPA联合小剂量As2O3可以降低单独应用As2O3导致的NB4细胞EGF表达的升高、并进一步降低Survivin的表达,As2O3联合VPA可降低As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病时的不良反应.
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IFN-α联合As2 O3对NB4细胞株VEGF及Survivin表达的影响
目的 探讨IFN-α联合不同浓度As2O3对NB4细胞株血管内皮生长因子(VEGF)、凋亡抑制蛋白(Survivin)表达的影响.方法 实验分不同浓度的As2O3 即 0、0.1、0.5、1.0、2.0μmol/L及不同浓度As2O3联合IFN-α共10组,利用MTT法检测细胞毒性反应,同时采用免疫组织化学方法 半定量分析NB4细胞VEGF、Survivin表达的动态变化.结果 Survivin在未加药组阳性率为93.8%,VEGF在未加药组阳性率为82.4%.As2O3(≤1.0μmol/L)作用后VEGF表达增加,但无统计学意义;Survivin表达下降(P<0.029).2.0μmol/L As2O3作用下两者表达均明显降低(P=0.006;P=0.000);联合IFN-α组两者表达均明显降低(P=0.000),分析两者呈正相关(r=0.8754).结论 IFN-α联合As2O3可降低VEGF、Survivin的表达,提示IFN可以降低As2O3 对NB4细胞凋亡抑制基因的表达,具有调控细胞凋亡的作用.
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槲皮素对体外培养NB4细胞株P53表达的影响
目的为研究治疗白血病的有效药物.方法将槲皮素作用于培养的NB4细胞株,应用RT-PCR及westernblot方法,研究不同浓度槲皮素(30、60、90μm)诱导细胞24、48、72、96、120h后,白血病NB4细胞株中突变型p53基因及蛋白表达的情况.结果证实其30～90μm浓度时对突变型p53基因没有影响,而对突变型p53蛋白的表达产生抑制作用.结论为槲皮素应用于白血病的研究提供了有效手段.
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冈田酸促进ATRA诱导NB4细胞的分化及增殖抑制
目的:研究蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OKA)对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化及增殖抑制作用的影响.方法:选用ATRA、OKA、ATRA+OKA分别作用于NB4细胞,采用MTT法测定细胞增殖率,瑞氏染色法和NBT还原实验观察细胞形态的变化,流式细胞仪分析细胞表面CD11b的表达,丝/苏氨酸磷酸化酶试剂盒检测细胞内PP2A活性.结果:(1)MTT结果显示,OKA对NB4细胞增殖的抑制作用不明显;ATRA、ATRA+OKA作用7天,对NB4细胞的增殖抑制率分别为25.1%、38.4%,ATRA+OKA组与其他两组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).(2)细胞形态学、NBT及流式细胞仪结果显示,加入OKA能促进ATRA诱导的NB4细胞分化.(3)酶活性分析显示,ATRA诱导的NB4细胞分化过程中,PP2A活性较对照组明显下降,ATRA+OKA作用后PP2A活性下降更加明显.结论:OKA促进ATRA诱导的NB4细胞增殖抑制作用,可能通过抑制PP2A活性参与细胞分化过程.
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葛根总黄酮诱导NB4细胞凋亡的机制探讨
目的 探讨葛根总黄酮(PR)对人早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞株的影响.方法 MTT法检测NB4细胞增殖抑制率;FITC-Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡率;Western blot检测c-Jun氨基端激酶(JNK)、Bcl-2、PARP、半胱天冬酶(Caspase)3蛋白表达的变化.结果 PR呈时间-剂量依赖性抑制NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡;JNK、PARP及Caspase 3的表达与PR浓度呈正相关,而与凋亡抑制蛋白Bcl-2呈负相关.结论 PR可有效诱导NB4细胞凋亡,其作用与JNK信号途径的活化有关.
关键词： 葛根总黄酮 NB4细胞株 细胞凋亡 C-Jun氨基端激酶 -
新型维甲酸衍生物诱导NB4细胞分化的初步研究
目的:本研究探讨10种新型维甲酸衍生物对白血病细胞株NB4的抑制增殖和诱导分化活性.方法:维甲酸类衍生物作用于NB4细胞后,通过MTT法检测细胞的增殖.瑞氏染色法在倒置相差显微镜下观察加药处理前后细胞形态学变化.NBT还原实验法分析细胞的分化指标.FCM检测分析细胞周期和细胞表面分化抗原变化.结果:维甲酸衍生物作用3 d后,抑制细胞增殖作用呈剂量依赖效应.10种维甲酸衍生物(10-5mol/L)的诱导分化活性表现在油镜下观察NB4细胞向粒系分化成熟的改变,NBT阳性细胞率增加,细胞表面分化抗原CD11b表达量增加,CD13表达则减少.通过对细胞周期的分析,发现G0/G1期细胞表达量增加,呈G1期阻滞.结论:维甲酸衍生物2a-03,4a-02和5a-02显示有较强的诱导NB4细胞分化的活性.
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黄芪总苷诱导NB4凋亡过程中死亡受体通路分子变化
目的 探讨黄芪总苷(AST)诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡过程中死亡受体通路的各分子变化,以说明AST是否依赖死亡受体通路参与NB4细胞凋亡发生.方法 不同浓度AST(200、300、400 μg/ml)处理NB4细胞48 h后,RT-PCR法检测IKKβ、IκBα、NF-κBp65及Fas的mRNA表达变化,比色法检测caspase-8的相对活性.结果 不同浓度的AST能够引起IκBα mRNA表达上调、NF-κBp65 mRNA表达下调,caspase-8活性的升高,而IKKβ及Fas的mRNA表达无明显变化.结论 AST诱导NB4细胞凋亡,可能与死亡受体通路上IκBα mRNA表达上调、NF-κBp65 mRNA表达下调,caspase-8活性升高有关.
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三氧化二砷对NB4细胞珠端粒酶活性的影响
目的:观察三氧化二砷(As2O3)对NB4细胞珠端粒酶活性的影响,并探讨与细胞增殖、分化及细胞周期之间的关系.方法:应用MTT法、BNT法检测细胞的增殖抑制率、细胞分化率、流式细胞仪检测CD11b的表达率、细胞周期时相比率,以PCR为基础的TRAP法检测端粒酶活性.结果:As2O3能有效地使NB4细胞增殖抑制、诱导分化,伴随着端粒酶活性的变化为活性降低.细胞周期分析发现,G0/G1期高或S期低对应低水平端粒酶活性,G0/G1期低或S期高对应高水平端粒酶活性.结论:As2O3可抑制NB4细胞端粒酶活性,并与细胞分化、细胞周期时相有关.
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维甲酸耐药细胞与敏感细胞的差异表达蛋白分析
背景与目的:维甲酸耐药机制有待进一步的深入研究.蛋白质组学以所有蛋白质为研究对象,从细胞水平及整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律.本实验应用蛋白组学技术整体比较维甲酸耐药细胞与敏感细胞蛋白表达谱,筛选差异表达蛋白,以期获得维甲酸耐药相关蛋白.方法:提取维甲酸耐药细胞株MR2及维甲酸敏感细胞株NB4的总蛋白,通过双向凝胶电泳分离,获得二者高质量的蛋白表达谱,经PDQuest v7.1软件比较分析,筛选出二者间差异表达的蛋白质点,通过质谱仪鉴定表达差异的蛋白.结果:获得了分辨率高、重复性好的APL细胞的双向电泳图谱.PDQuest v7.1软件分析结果表明,MR2细胞及NB4细胞的pH 4～7双向凝胶电泳所展示的蛋白点分别有(890±45)个和(912±56)个.二者间有57个差异显著的蛋白点,其中23个在MR2细胞中上调,34个下调.经质谱鉴定了10个蛋白,鉴定成功率达70%,鉴定的蛋白涉及癌蛋白、细胞周期调控和信号转导相关蛋白质.结论:应用双向凝胶电泳技术整体展示了维甲酸耐药细胞株MR2及敏感细胞株NB4的蛋白表达谱,并分析、鉴定、筛选出与维甲酸耐药相关的差异表达蛋白,为进一步从多因素角度研究认识维甲酸耐药机制提供了新的线索.
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IFNγ联合全反式维甲酸对白血病细胞株NB4、MR2增殖和分化的影响
背景与目的:全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)的应用,使90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者获得了完全缓解,但维甲酸耐药的快速发生成为ATRA治疗APL的一大缺憾.许多研究表明ATRA耐药与缺乏干扰素合成的某些蛋白质有一定的关系,本研究拟探讨干扰素联合ATRA作用抑制ATRA耐药APL细胞增殖和分化的可能性及其机制.方法:γ干扰素(interferon γ,IFNγ)、ATRA单独或联合作用于ATRA敏感细胞株(NB4)及ATRA耐药细胞株(MR2)后,采用MTY法检测细胞的增殖,用光镜观察和NBT还原实验检测细胞的分化,间接免疫荧光法观察早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)蛋白表达的情况.结果:第8天时,IFNγ组、ATRA组和(IFNγ+ATRA)组NB4细胞的生长抑制率依次为68.0%、85.0%和95.2%;MR2细胞的生长抑制率依次为24.1%、4.3%和51.5%.联合用药组NB4细胞、MR2细胞的生长抑制率明显高于单独用药组(P＜0.05).第3天时,IFNγ组、ATRA组和(IFNγ+ATRA)组NB4细胞的NBT阳性率依次为19.3%、74.7%和93.3%,MR2细胞的NBT阳性率依次为16.8%、5.2%和31.5%,联合用药组NB4细胞、MR2细胞的NBT阳性率明显高于单独用药组(P＜0.05).IFNγ作用后,NB4细胞和MR2细胞核内的荧光颗粒较对照组明显增多.结论:IFNγ与ATRA具有协同作用,二者联合应用不仅能够增强ATRA对NB4细胞和MR2细胞的增殖抑制作用,而且能够部分诱导对ATRA耐药的MR2细胞发生分化.
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威灵仙总皂苷诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4分化作用的研究
目的 研究威灵仙总皂苷对NB4细胞分化的影响.方法 取对数生长期的NB4细胞,设置多个浓度梯度的威灵仙总皂苷药物组,观察用药后不同时间点NB4活细胞数,计算生长抑制率;Wright's-Giemsa染色计数法和NBT还原试验测定细胞分化率,透射电镜观察细胞形态学变化;流式细胞术检测CD11b/CD33表达情况.结果 与空白对照组比较,威灵仙总皂苷对NB4细胞有明显的生长抑制作用,且具有剂量-效应依赖关系;但具有统计学意义的诱导分化现象不明显.结论 威灵仙总皂苷可有效抑制NB4细胞增殖,但对NB4细胞无明显的诱导分化作用.
关键词： 威灵仙总皂苷 急性早幼粒细胞白血病 NB4细胞株 细胞分化 -
复方黄黛片含药兔血清对NB4细胞株作用的实验研究
目的 观察复方黄黛片含药兔血清对NB4细胞株的影响.方法 以兔为实验血清的供体,以给药与否为分组依据,采用双道原子荧光法检测血清中砷剂的浓度,以细胞抑制率及调亡率为观察指标,对实验结果 进行分析.结果 (1)给药前、后兔血清中砷剂差异显著;(2)两组兔血清对NB4细胞株生长均有抑制作用,且对NB4细胞株生长的抑制作用具有一定的浓度及时间依赖性;(3)两组兔血清均可诱导NB4细胞株发生凋亡,且该作用具有一定的浓度及时问依赖性.结论 (1)复方黄黛片含药兔血清可明显抑制人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株的生长,抑制作用呈一定的浓度、时间依赖性;(2)复方黄黛片含药兔血清可诱导人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株发生凋亡,该作用呈一定的浓度、时间依赖性;(3)中药血清药理学方法 可用于深入研究复方黄黛片抗白血病的作用机理.
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复方黄黛片含药兔血清对NB4细胞株作用的研究
目的 研究复方黄黛片含药兔血清对NB4细胞株的作用.方法 以免为实验血清的供体,以给药与否及血清灭活与否为分组依据,采用双道原子荧光法检测血清中砷的浓度,以细胞抑制率及凋亡率为观察指标,对实验结果进行分析.结果 (1)给药前、后兔血清中砷剂浓度分别为(0.01±0.001)mg/L和(0.11±0.006)mg/L,差异显著;(2)四组兔血清对NB4细胞株生长均有抑制作用,且对NB4细胞株生长的抑制作用具有一定的浓度及时间依赖性;(3)四组兔血清均可诱导NB4细胞株发生凋亡,且该作用具有一定的浓度及时间依赖性.结论 (1)复方黄黛片含药兔血清可明显抑制人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株的生长、抑制作用呈一定的浓度、时间依赖性;(2)复方黄黛片含药兔血清可诱导人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株发生凋亡,该作用呈一定的浓度、时间依赖性;(3)中药血清药理学方法用于深入研究复方黄黛片抗白血病作用机理,能够较真实反映机体血药浓度下的作用及变化规律,能够全面展示复方黄黛片各组分的共同作用,具有可行性和科学性.
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补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL-60、K562作用的研究
目的 探讨补骨脂素(PSO)加长波紫外线(UVA)光化学疗法对人白血病细胞株NB4、HL-60、K562的作用.方法 以NB4、HL-60、K562细胞株为研究对象,以细胞抑制率、凋亡率及在电镜下细胞超微结构改变为检测指标,观察PSO加波长360nm的UVA对人白血病细胞株的影响,并分析各因素间的交互作用.结果 当PSO浓度均为80 μg/ml,UVA照射时间分别为10min、15min和15min时,NB4、HL-60、和K562细胞的抑制率分别达峰值;当PSO浓度分别为40μg/ml、80μg/ml和80μg/ml,UVA照射时间为10mjn、15min和15min时,NB4、HL-60和K562细胞的凋亡率达峰值.不同PSO浓度、不同UVA照射时间对不同白血病细胞株的抑制率、凋亡率的差异有统计学意义,且各因素之间有交互作用.电镜下观察经PSO和UVA处理后的NB4、HL-60及K562细胞超微结构,均可见明显的凋亡形态学改变.结论 PSO加UVA(PUVA)可抑制白血病细胞株NB4、HL-60、K562的生长,并可诱导其凋亡.浓度为40～80 μg/ml PSO与波长为360nm的UVA照射10～15min是PUVA抗NB4、HL-60、K562白血病细胞的佳作用点.
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丹参酮ⅡA与全反式维甲酸协同诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株的分化和凋亡
目的研究丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA, TanⅡA)联合全反式维甲酸(ATRA)对早幼粒细胞白血病细胞(NB4)诱导分化及凋亡的协同效应.方法0.5 μg/ml TanⅡA分别联合0.5 μg/ml、0.25 μg/ml和0.125 μg/ml ATRA作用NB4细胞5 d,观察NB4细胞形态学变化,检测硝基蓝四氮唑(NBT)还原能力;流式细胞术检测CD11b,CD33的表达,并进行细胞周期和细胞凋亡分析.结果TanⅡA联合ATRA可协同诱导NB4细胞分化和凋亡.联合作用组第5 d细胞生长抑制率均超过80%;90%左右的NB4细胞分化,其中杆状和分叶核细胞比例超过65%;NBT还原能力显著升高.流式细胞术分析显示CD11b表达升高,CD33表达降低;G0/G1期细胞增加,有明显的细胞凋亡,与TanⅡA或ATRA单独作用组相比均有显著性差异(P<0.01).TanⅡA与ATRA(0.125 μg/ml～0.5 μg/ml)联合对NB4细胞的影响没有明显的浓度依赖倾向.结论TanⅡA联合ATRA对NB4细胞诱导分化和凋亡有协同作用;在ATRA一定浓度范围内,这种协同作用无ATRA剂量依赖性.
