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类叶升麻苷对冈田酸诱导的阿尔茨海默病细胞模型的保护作用研究
目的:研究类叶升麻苷(acteoside)对冈田酸(0A)诱导的SK-N-SH神经细胞损伤的影响.方法:以20 nmol·L-1的冈田酸处理SK-N-SH神经细胞,建立AD样细胞模型,并以5,10,20 mg·L-1的类叶升麻苷拮抗其作用.通过倒置显微镜观察细胞形态,采用MTT比色法检测细胞存活率,酶标法试剂盒测定LDH渗漏率,应用Western blot技术检测神经细胞磷酸化tau蛋白的表达情况.结果:类叶升麻苷可明显改善SK-N-SH的细胞形态,提高细胞的存活率,降低细胞LDH的漏出率,下调磷酸化tau蛋白在p-Ser 199/202,p-Ser 404位点的表达,上调非磷酸化tau蛋白在Ser 202,Ser 404位点的表达.结论:类叶升麻苷对冈田酸诱导的SK-N-SH神经细胞损伤具有明显保护作用.
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调心方药物血清对动物阿尔茨海默病相关的tau蛋白磷酸化的调节作用
目的:研究调心方对动物阿尔茨海默病相关的tau蛋白磷酸化的调节及其可能的作用机制.方法:采用冈田酸(Okadaic acid)处理NG108细胞模型,MTT比色法、蛋白印迹法、免疫共沉淀等方法进行测定.结果:MTT方法观察到磷酸脂酶抑制剂冈田酸(20nmol/L)处理NG108细胞12h能导致细胞活性明显下降,调心方药物血清能改善细胞的活性;多种tau蛋白抗体免疫印迹法见调心方药物血清能逆转冈田酸导致的NG108细胞tau蛋白过度磷酸化.免疫共沉淀研究观察到调心方提取液抑制tau蛋白与可调节tau蛋白磷酸化的早老蛋白-1(Presenilin-1)的结合.结论:调心方能抑制tau蛋白的过度磷酸化,其部分机制可能与调心方调节早老蛋白-1与tau蛋白结合有关.
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冈田酸诱导大鼠海马神经元Tau 蛋白过度磷酸化
目的研究蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)对海马神经元微管相关蛋白(Tau)磷酸化的影响,建立Tau过度磷酸化的大鼠模型.方法实验随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA模型组.模型组又分为OA 12 h、24 h、48 h和2周组.OA模型组大鼠海马CA1区背侧定向注射1.5μl溶于10%DMSO的OA,DMSO对照组注射1.5 μl 10%DMSO溶液.通过Bielschowski染色、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分别观察海马神经元形态的改变和磷酸化Tau的表达水平;检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,了解其动态变化与Tau磷酸化的关系.结果OA模型各组与正常组和DMSO对照组比较,Bielschowski染色示海马神经元胞体和突起着色较深,欠均匀,部分神经元轴丘处浓染成斑块状,但各模型组均未见到老年斑和神经元纤维缠结样改变;免疫组织化学染色示模型组海马神经元Thr231和Ser199/202磷酸化Tau蛋白表达增加,与DMSO对照组相比具有显著意义(P＜0.05);蛋白免疫印迹提示OA可引起Tau蛋白Thr231、Ser396和Ser199/202位点发生磷酸化,且不同位点磷酸化的稳定性不同,注射OA 48h后PP2A的活性明显降低,其变化与Tau蛋白Thr231和Ser396位点的磷酸化改变相一致.结论海马CA1区背侧单次注射OA可诱导建立神经元Tau蛋白过度磷酸化的大鼠模型.
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PP2A激活剂对HL-60细胞增殖的影响及急性髓系白血病患者体内PP2A活性变化的研究
本研究探讨蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphotase 2A,PP2A)激活剂或抑制剂对体外HL-60细胞增殖的影响及急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者体内单个核细胞中PP2A的活性变化.单独使用PP2A激活荆FRY720或FTY720联合冈田酸(OA)处理HL-60细胞24小时,应用CCK8试剂盒检测细胞的增殖状况;同时选取20例初发或复发的AML患者,使用PP2A免疫沉淀磷酸酶活性检测试剂盒检测AML患者及正常对照组外周血单个核细胞中PP2A活性,使用SPSS 16.0软件对数据进行分析.结果显示:FTY720组细胞增殖受到明显抑制,与对照组相比差异有显著性(p＜0.05);FTY720+OA组细胞增殖受到轻微抑制,与对照组相比差异无显著性(p＞0.05),与FTY720组相比差异有显著性(p＜0.05).AML患者单个核细胞PP2A的活性(453.67±102.52pmol磷酸盐)与正常人(673.29±96.32 pmol磷酸盐)比较明显降低,两组之间差异有显著性(p＜0.01).结论:PP2A的激活或抑制能影响HL-60细胞的增殖;AML患者单个核细胞中PP2A的活性有所降低.PP2A蛋白与AML的发生、发展密切相关,对AML的诊断及治疗可能有参考价值.
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蛋白磷酸酶抑制剂对离体海马组织tau蛋白磷酸化的影响
老年变性型痴呆(AD)患者神经元内出现神经原纤维缠结(NFT)、老年斑(SP)的形成及神经元的丢失为其主要病理学改变.NFT的核心是过度磷酸化的tau蛋白.我们于2001年11月至2003年8月年采用离体培养海马片,经用磷酸酶抑制剂冈田酸(okadaic acid)处理后,观察tau蛋白磷酸化的改变及其相关酶的变化,以期寻找一种适于研究的体外AD模型.
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蛋白磷酸酶2A抑制剂通过c-Jun氨基末端激酶/蛋白激酶B通路抑制胰腺癌细胞生长的机制
斑蝥素是蛋白磷酸酶2A( protein phosphatase 2A,PP2A)的抑制剂[1].PP2A可使c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)等参与细胞生长的多种激酶去磷酸化而失活.本研究拟检测斑蝥素和经典的PP2A抑制剂冈田酸对胰腺癌细胞JNK/Akt信号通路的活性及细胞生长的影响.
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骨髓间充质干细胞对冈田酸致神经细胞损伤的修复作用
目的 观察人骨髓间充质干细胞对冈田酸(OA)损伤的神经细胞是否具有修复作用.方法 应用冈田酸损伤神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞,建立阿尔茨海默病体外模型.将细胞分成正常组、损伤组和治疗组,损伤组用20nmol/L冈田酸损伤24h,治疗组在损伤24h后加入骨髓间充质于细胞的条件培养基治疗24h.采用CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色微管微丝测定细胞树突长度和荧光面积,Western blotting检测磷酸化Tau蛋白和总Tau蛋白含量.结果 冈田酸能损伤SH-SY5Y细胞,使其胞体皱缩、塌陷,出现空泡,树突缩短、断裂,微管微丝排列紊乱,而骨髓间充质干细胞条件培养基可使SH-SY5Y细胞胞体变得圆润,树突重新恢复变长,微管、微丝致密规则,荧光变强;并且能有效降低冈田酸诱导的Tau蛋白过度磷酸化水平.结论 骨髓间充质干细胞对冈田酸损伤的神经细胞具有明显的修复作用.
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短期高脂饮食缓解冈田酸诱导的大鼠认知功能损伤
观察短期高脂饮食对阿尔茨海默病模型鼠认知功能损伤的影响及相关机制.建立阿尔茨海默病模型并给予高脂饮食喂养后,对大鼠进行水迷宫(Morris water maze,MWM)行为学实验检测动物的学习记忆能力.取材后对海马切片进行尼氏染色检测神经元损伤,Western blot检测NLRP3 (NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3)和caspase-1通路的表达.水迷宫结果表明短期高脂饮食能缓解冈田酸造成认知功能损伤,海马病理检测表明短期高脂饮食可能通过调节NLRP3及caspase-1信号通路缓解对神经元的损伤,发挥了神经保护功能.
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左旋黄皮酰胺对冈田酸和β淀粉样肽25-35神经毒性的保护作用
探讨左旋黄皮酰胺对冈田酸(okadaic acid,OA)诱导的人神经瘤细胞(SH-SY5Y)和去卵巢(ovariectomy,OVX)及单侧侧脑室注射Aβ25-35所致神经元损伤的保护作用.通过MTT试验、LDH释放测定试验、Hoechst 33258荧光染色试验以及SH-SY5Y细胞检测,考察左旋黄皮酰胺拮抗冈田酸诱导的细胞毒作用.通过避暗试验、电镜检测、Nissl体染色及HE染色,考察左旋黄皮酰胺对去卵巢及侧脑室注射Aβ25-35大鼠神经元的保护作用.左旋黄皮酰胺可明显拮抗冈田酸诱导的细胞毒作用,提高去卵巢及侧脑室注射Aβ25-35大鼠的学习记忆能力,保护海马及皮层神经元.左旋黄皮酰胺可拮抗冈田酸及Aβ25-35诱导的神经毒性,具有神经保护作用.
关键词： 左旋黄皮酰胺 阿尔茨海默病 冈田酸 β淀粉样肽25-35 神经保护作用 -
冈田酸抑制胰腺癌细胞株PANC-1迁移及其增殖作用
目的 研究冈田酸(蛋白磷酸酶2A抑制剂,PP2A)抑制胰腺癌细胞株PANC-1迁移的过程并研究其增值机制.方法 把PANC-1细胞分成等量的4组:对照组,实验-Ⅰ组、实验-Ⅱ组、实验-Ⅲ组,对照组不作处理,实验-Ⅰ组:用冈田酸处理,实验-Ⅱ组用Wnt/β-catenin通路抑制剂(FH535)处理,实验-Ⅲ组用冈田+ FH535联合处理.用显微拍照计量面积方法来评估细胞迁移率,用面板吸光比率来评估细胞活性.结果 实验-Ⅰ组和对照组在2,4,6h的迁移率分别为16.28％,18.13％:21.94％,25.34％;27.67％,70.64％,实验-Ⅰ组在2,4,6h这3个时间点的迁移率均明显低于对照组,差异有统计学意义(均P ＜0.05),表明冈田酸对胰腺癌细胞株PANC-1的迁移能力有抑制作用.实验-Ⅱ组与实验-Ⅲ组细胞活性在0,6,12,18 h分别为52.39％,51.81％;49.57％,30.67％;30.64％,12.57％;15.91％,3.59％,2组这4个时间点的细胞活性均明显低于对照组,差异有统计学意义(均P＜0.05),表明冈田酸对胰腺癌细胞中Wnt/3-catenin通路的活性有下调作用;冈田酸对胰腺癌细胞株迁移及增殖的抑制作用被Wnt/β-catenin通路抑制剂削弱,可得出冈田酸对胰腺癌细胞株PANC-1迁移及增殖的抑制作用有可能基于Wnt/β-catenin信号通路.结论冈田酸之所以能够抑制胰腺癌细胞株PANC-1的迁移及增殖,其机制可能是对Wnt/β-catenin信号通路的活性抑制下调.
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异丙酚预处理对拟AD模型大鼠海马CA1区ChAT表达的影响
目的 观察异丙酚预处理对拟阿尔茨海默病(AD)大鼠海马CA1区胆碱乙酰转移酶(choline acetyl-transferase,ChAT)表达的影响,分析异丙酚的脑保护作用.方法 30只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、拟AD模型组(简称模型组)和异丙酚预处理组(简称异丙酚组).模型组、异丙酚预处理组在大鼠海马CA1区微量注射冈田酸(Okadaic acid,OA),建立拟AD大鼠模型.异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min,腹腔注射异丙酚100 mg/kg.然后用免疫组化方法观察大鼠海马CA1区ChAT的表达.结果 30只大鼠顺利完成全部实验的有27只,模型组和异丙酚预处理组有2只大鼠死亡、1只出现偏瘫无法进行余下实验,这可能与动物的个体差异不能耐受实验有关.随机取27只大鼠作为结果分析样本(每组9只).①模型组与对照组大鼠相比:海马CA1区ChAT免疫组化阳性表达明显减少(P＜0.05);②异丙酚预处理组与模型组大鼠相比:海马CA1区ChAT免疫组化阳性表达明显增多(P＜0.05).结论 拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能增强ChAT的表达,有明显的脑保护作用.
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丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1/2A在缺氧预处理诱导人脐静脉内皮细胞耐受中的作用
目的 研究丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1/2A (PP1/2A)在调节人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对缺氧耐受相关信号转导中的作用.方法 采用缺氧预处理诱导HUVEC对缺氧损伤的耐受.采用细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)释放及总抗氧化能力(T-AOC)评价HUVEC的耐受性.免疫细胞化学联合蛋白质印迹法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)的亚细胞定位.蛋白质印迹法检测应激蛋白血红素氧合酶1(HO-1)的表达. 结果 缺氧90 min导致HUVEC存活率及T-AOC 降低,LDH释放增加.缺氧预处理(缺氧10 min 后4, 8及24 h)可提高HUVEC对随后缺氧90 min的耐受,细胞存活率及T-AOC较缺氧组显著提高,LDH 释出显著降低,并诱导Nrf2由胞浆向胞核移位,上调其下游信号分子HO-1的表达.缺氧预处理前用PP1/2A特异性抑制剂冈田酸(40 nmol·L-1)孵育HUVEC 10 min可部分抑制缺氧预处理诱导的Nrf2向核移位、HO-1表达及细胞耐受性.结论 PP1/2A至少部分参与缺氧预处理诱导HUVEC对缺氧损伤的耐受,其机制可能与调节Nrf2向核移位及HO-1表达有关.
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蛋白丝/苏氨酸磷酸酶1和2A抑制药对大鼠三叉神经元电压依赖性钠通道的影响
目的通过研究蛋白丝/苏氨酸磷酸酶1和2A特异性抑制药冈田酸对大鼠三叉神经元电压依赖性钠电流的影响,探讨磷酸酶在细胞信号转导中的作用.方法在成年大鼠三叉神经元上进行全细胞膜片钳记录.结果1 μmol*L-1冈田酸显著抑制总钠电流(INa-T),仅轻微抑制毒素不敏感型钠电流(INa-TTX-R),其抑制率分别为(20±13)%(n=9, P<0.05)和(4±3)%(n=6, P<0.05).冈田酸对INa-T的激活曲线产生明显的超极化位移,半激活电压从给药前的-(13±8)mV升至给药后的-(16±7)mV(P<0.05), 但是对INa-TTX-R的激活曲线没有影响.结论①蛋白丝/苏氨酸磷酸酶参与了大鼠三叉神经元电压依赖性钠通道的调节.②大鼠三叉神经元存在多种电压依赖性钠通道,它们对冈田酸具有不同的敏感性.
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冈田酸对培养的大鼠三叉神经元电压门控性钾和钙通道的调节
目的 通过研究冈田酸对大鼠三叉神经元电压门控性钾、钙电流的影响,探讨磷酸酯酶在细胞信号转导中的调节作用.方法 采用全细胞膜片钳方法.结果 冈田酸1 μmol·L-1对瞬时外向钾电流(IA)的抑制率为28.6%,对延迟整流钾电流(IK)和钙电流(Ica)的增加率分别为22.7%和20.0%.冈田酸1 μmol·L-1使IA和IK的激活曲线以及IA的失活曲线发生超级化位移,对Ica激活和失活曲线的影响没有统计学意义.结论 ①蛋白丝/苏氨酸磷酸酯酶1和2A可能参与了大鼠三叉神经节神经元电压门控性钾和钙通道的调节.②电压门控性钾和钙通道对蛋白丝/苏氨酸磷酸酯酶1和2A的去磷酸化反应表现出不同的依赖性.
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雌激素对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响
目的 研究雌激素对冈田酸诱导的人神经母细胞瘤系(SH-SY5Y)细胞tau蛋白磷酸化的影响.方法 四甲基偶氮唑盐观察冈田酸对SH-SY5Y细胞活力的影响,模拟AD时tau蛋白过度磷酸化细胞模型;Western blot检测冈田酸及雌激素对Thr231 tau蛋白磷酸化的影响.结果 四甲基偶氮唑盐结果表明,当冈田酸浓度＞40 nmol/L时,细胞活力受到明显抑制,＜40 nmol/L的冈田酸对细胞活力没有明显的影响;Western blot结果表明,SH-SY5Y细胞经冈田酸处理后,tau蛋白磷酸化的水平明显增加,这种作用可被雌激素所抑制.结论 雌激素抑制了冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞的tau蛋白磷酸化水平.
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Alzheimer样磷酸酯酶缺陷导致神经细丝异常磷酸化和聚积
目的研究Alzheimer病(AD)样蛋白磷酸酯酶缺陷与神经细丝异常的关系,探讨神经细丝在AD发病中的作用.方法用蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)处理人成神经瘤细胞(SY5Y)后,用倒置显微镜,免疫组化,生物化学等技术观察细胞形态,神经细丝的表达、磷酸化和细胞定位以及细胞毒性作用.结果未经处理的SY5Y细胞中被SMI32识别的非磷酸化神经细丝在细胞体和突起中均被检测,但在胞体中的含量特别丰富;被SMI34识别的磷酸化神经细丝则主要在细胞的表层和突起部分被检测.用OA处理后,非磷酸化神经细丝的显色反应随OA浓度增加而显著减弱;而磷酸化神经细丝的显色则随OA浓度增加而明显增强,并由轴丘向胞体聚积.免疫印迹结果显示:OA处理使SMI34显色呈剂量依赖性增高.OA在引起神经细丝异常改变的同时,对细胞产生剂量依赖性毒性作用:15 nnol/L OA使SY5Y细胞光泽度降低,数目减少,轴突长度缩短,细胞活性降低;当OA浓度增加至30nmol/L时,上述细胞毒性作用增强,并出现大量无光泽,无突起的圆形细胞;当OA浓度达45 nmol/L时,全部细胞均漂浮死亡.结论蛋白磷酸酯酶缺陷导致神经细丝的异常磷酸化和聚积,这一过程很可能参与AD神经原纤维变性.
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冈田酸对全反式维甲酸诱导NB4、MR2细胞分化的影响
目的 探讨丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OKA)对全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化的影响,探讨PP2A活性与白血病细胞ATRA耐药的关系.方法 用ATRA、OKA、ATRA+OKA分别作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞及其耐药细胞系MR2细胞,采用瑞特染色法和NBT还原实验观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞表面CD11b表达,丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶试剂盒检测细胞内PP2A活性,Western blot法检测细胞内PP2A各亚基表达.结果 ①细胞形态学、NBT还原实验及流式细胞术检测结果均显示,加入OKA抑制蛋白磷酸化酶活性能促进ATRA诱导的NB4细胞分化,并协同ATRA能诱导其耐药细胞MR2细胞发生部分分化.②酶活性分析显示,未处理的NB4细胞PPA活性为(959±83)pmol磷酸盐·min-1,μg蛋白-1;ATRA诱导NB4细胞分化过程中,PP2A活性明显下降[(534±43)pmol磷酸盐·min-1.μg蛋白-1],ATRA+OKA组PP2A活性下降更加明显[(229±23)pmol磷酸盐·min-1·μg蛋白-1];单用ATRA作用于MR2细胞,则PP2A活性无明显影响,而ATRA+OKA诱导MR2细胞分化中,PP2A活性下降.③Western blot.结果 显示,ATRA作用5d的NB4细胞中PP2A-C亚基表达较对照组明显减少,而A和B亚基表达与对照组比较变化不明显;在MR2细胞中,A、B和C亚基表达在处理组与对照组之间无明显差别.结论 ATRA诱导的NB4细胞分化过程中细胞内PP2A-C表达减少,PP2A活性降低.ATRA不能有效抑制MR2细胞内PP2A的活性,可能是MR2细胞对ATRA耐药的机制之一.
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Nec 1对冈田酸诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用
目的：观察 Nec 1对冈田酸(OA)诱导的大鼠皮层神经元损伤是否有保护作用。方法采用原代皮层神经元培养方法，通过检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放及 Calcein AM 染色观察 Nec 1对 OA 诱导大鼠皮层神经元损伤的抑制作用。结果Nec 1(100μmol/L)抑制 OA 引起的细胞活力的降低，使其增加19%(P <0.01)；抑制 OA 引起的活细胞数的减少，使活细胞数增加20%(P <0.01)；抑制 OA 引起的 LDH 释放的增加，使 LDH 释放减少21%(P <0.01)。结论 Nec 1可有效抑制 OA 引起的皮层神经元的损伤，发挥神经保护作用。
关键词： 坏死性凋亡 necrostatin1 冈田酸 神经元损伤 -
拟Alzheimer病简易大鼠模型的制备
目的:制备拟Alzheimer病的简易大鼠模型.方法:大鼠海马CA1区微量注射冈田酸(Okadaic acid OA)隔日1次,共4次,采用Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力,免疫组化法观察大鼠海马过度磷酸化tau蛋白的表达,并与正常对照组比较.结果:与对照组比较,模型组大鼠学习记忆能力下降,海马磷酸化tau蛋白表达显著增强.结论:大鼠海马CA1区多次微量注射OA可制备简易拟Alzheimer病大鼠模型.
关键词： Alzheimer病 冈田酸 学习记忆 Tau蛋白 -
凋亡调节蛋白在蛋白磷酸酶抑制剂所诱导的大鼠脑神经细胞退化中的表达分析
目的:在体内水平探讨凋亡调节蛋白Bcl-2/Bax在蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸所致的神经细胞退化中的表达情况及其影响.方法:采用大鼠脑皮质定位注射冈田酸的模型,应用免疫组化染色法检测冈田酸所诱导的Bcl-2和Bax蛋白表达情况,用图像分析技术和光学显微镜测微网格分别计数Bcl-2和Bax免疫阳性细胞.结果:Bcl-2和Bax蛋白在大鼠脑额叶皮质有广泛性的基础表达,冈田酸能特异性诱导Bcl-2和Bax蛋白高表达,相邻平面脑片的Bcl-2免疫阳性细胞的分布范围和细胞数目大于和多于Bax免疫阳性细胞.结论:冈田酸诱导凋亡相关调节蛋白Bcl-2和Bax高表达,提示Bcl-2/Bax相关凋亡调节机制参与冈田酸所致神经细胞退化过程;Bcl-2阳性细胞的分布范围和细胞数目大于和多于Bax阳性细胞,提示神经细胞可能存在内在抗损伤机制增加对冈田酸所致损伤的耐受性.
