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CD123单抗修饰的载丹参酮ⅡA免疫脂质体的制备及其体外评价
研制CD123单抗修饰的载丹参酮ⅡA免疫脂质体(CD123-TanⅡA-ILP),以期实现对白血病细胞的主动靶向给药.采用正交试验法优化脂质体处方,薄膜分散-探头超声法制备载丹参酮ⅡA长循环脂质体(TanⅡA-LP),以后插入法得到CD123-TanⅡA-ILP.流式细胞术检测NB4细胞对脂质体的摄取率,改良MTT法检测CD123-TanⅡA-ILP对NB4细胞的增殖抑制作用.研究结果表明,NB4细胞对CD123单抗修饰的免疫脂质体的摄取显著高于对游离药物及其载药脂质体的摄取;TanⅡA,TanⅡA-LP和CD123-TanⅡA-ILP与NB4细胞共培养48h,其IC50分别为20.87,11.71,7.17μmol·L-1.CD123-ILP有望为AML的治疗提供新的靶向给药策略.
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全反式维甲酸诱导NB4和HL-60细胞分化过程中髓系分化相关的转录因子表达变化
造血干细胞的自我更新、增殖、分化与成熟过程与转录因子调节密切相关.转录因子功能失调可能导致急性髓系白血病的发生.为研究急性髓系白血病细胞体外分化过程中转录因子表达变化,采用全反式维甲酸诱导NB4和HL-60细胞分化模型,瑞氏-姬姆沙染色现察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志CD11b的表达,定量RT-PCR检测转录因子PU.1,C/EBPα,ε,γ,GATA-1,GATA-2 mRNA的表达水平,用2(-△△CT)法对转录因子mRNA表达水平进行相对定量分析,并与对照组比较.结果表明:ATRA作用NB4细胞96小时,PU.1,C/EBPe mRNA表达水平显著上调,分别达到处理前的5.75倍和6.16倍;而C/EBPα,γ,GATA-1,GATA-2的mRNA表达水平均显著下调,仅为处理前的62%,31%,63%,8.7%,尤以GATA-2的表达水平下降为显著.在HL-60细胞,ATRA作用96小时,PU.1,C/EBPα,ε的mRNA表达水平上调,分别为处理前1.97,1.95,2.35倍,而C/EBPγ,GATA-1,GATA-2的mRNA表达水平均显著下调,仅为处理前的20%,21%,18%.结论:转录因子异常表达在急性髓系白血病的发病中起重要作用.
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三丁酸甘油酯诱导白血病细胞分化及凋亡机制的研究
为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂三丁酸甘油酯(tributyrin,TB)诱导NB4、K562白血病细胞分化和(或)凋亡的作用机制,利用Western blot方法及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TB作用前后NB4、K562细胞组蛋白H3乙酰化水平以及p21WAF1表达量的改变.结果表明:NB4(或K562)细胞经TB0.1 mmol/L(或TB 0.5 mmol/L)作用16小时后可见组蛋白H3乙酰化水平明显上升,并有剂量依赖效应.NB4、K562细胞经TB 0.1 mmol/L作用后可见p21WAF1 mRNA表达上调,且具有剂量依赖效应.p21WAF1 mRNA的这种上调开始于TB作用2小时后,16小时达高峰,可维持48小时.结论:TB诱导NB4、K562细胞发生分化和(或)凋亡的机制与TB引起细胞组蛋白高乙酰化和继而上调p21WAF1表达有关.
关键词： tributyrin NB4 K562 组蛋白乙酰化 p21WAF1 -
氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞分化作用的影响及其机制的初步探讨
为了研究氨肽酶抑制剂乌苯美司(bestatin)对全反式维甲酸(ATRA)诱导人APL细胞株NB4细胞分化作用的影响及其可能机制,NB4细胞经bestatin和ATRA单用或联合应用处理一定时间后,用光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测CD11b表达,四氮唑蓝(NBT)还原实验检测分化细胞功能,RT-PCR法检测c-myc和c-EBPεmRNA表达,Western blot检测c-Myc蛋白表达.结果显示:NB4细胞经100μg/ml bestatin和10 nmol/L ATRA联合处理72小时后,其分化的形态更明显;100μg/ml bestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时,能增强NB4细胞的NBT还原能力,与单用相应浓度ATRA组相比,差异显著(P＜0.01);从48-96小时,100μg/ml bestatin能增强10 nmol/L ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力,且呈时间依赖性,与相应时间点ATRA组相比,差异明显(P＜0.01);与单用10 nmol/L ATRA组相比,ATRA(10 mmol/L)和bestatin(100μg/ml)联用处理72小时,NB4细胞CD11b阳性表达率明显增加(P＜0.01);与单用10 nmol/L ATRA组相比,联用100μg/ml bestatin处理4小时后,NB4细胞c-myc mRNA表达的降低更明显(P＜0.05);50、75、100μg/ml bestatin与10 nmol/L ATRA联合处理8小时后,NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显降低,与单用ATRA组相比差异显著(P＜0.05);药物联用各组NB4细胞c-Myc蛋白表达水平与NBT还原能力之间呈负相关(r=-0.940,p=0.017);与100μg/ml bestatin联用不能增强10 nmol/L ATRA上调c-EBPεmRNA的表达;50、75、100μg/ml bestatin单独处理对NB4细胞的分化无影响.结论:氨肽酶抑制剂bestatin能够增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用,这可能与bestatin协同ATRA下调c-myc的表达有关.
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Survivin基因在NB4细胞株细胞和急性早幼粒细胞白血病细胞表达及其抗凋亡作用与临床意义
为了检测survivin基因在APL细胞中的表达率并探讨其表达与临床的相关性,本研究采用RT-PCR方法检测PML/RARα和survivin mRNA表达.结果显示:NB4细胞经过ATRA处理后,survivin mRNA表达随着时间的延长而逐渐下降,在72小时几乎检测不到survivin mRNA表达.36例初发、复发APL患者骨髓单个核细胞均有PML/RARα融合基因表达,其中survivin mRNA阳性表达24例(占67%),阴性表达12例(占33%);22例缓解期APL患者骨髓单个核细胞PML/RARα融合基因表达均为阴性,其中survivin mRNA阳性表达8例(占36%),阴性表达14例(占64%);初发、复发组、PML/RARα基因长型阳性组与缓解组相比,survivin mRNA表达阳性率均明显增高(两者P值均＜0.05),而与急性白血病组相比survivin mRNA表达阳性率均明显减低(两者P值分别＜0.05,＜0.001).36例初发、复发APL患者,无论survivin mRNA表达阳性或阴性,用ATRA治疗都能达到完全缓解;临床上并发DIC和严重感染的4例APL患者的survivin mRNA表达皆为阳性(其中1例死亡),而survivin mRNA表达阴性患者临床症状均较轻,只有轻微的皮肤粘膜出血、发热和乏力等症状.2例APL患者经用ATRA治疗后外周血象以及骨髓象诱导分化症象不明显者,其survivin mRNA表达均为阳性.结论:APL患者骨髓单个核细胞survivin基因阳性表达率较其它类型急性白血病明显减低,survivin基因表达与临床有一定的相关性.
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沉默SIRT2基因对急性粒细胞白血病细胞增殖的影响
目的 SIRT2是组蛋白去乙酰化酶家族成员之一,其参与多种肿瘤的发生和发展.本研究旨在探讨SIRT2基因在人急性粒细胞白血病细胞NB4和耐药细胞HL60/A增殖中的作用,分析SIRT2对于细胞周期的影响,寻找治疗急性粒细胞白血病的新靶点.方法 蛋白质印迹法检测SIRT2在急性粒细胞白血病细胞HL60/A和NB4中的表达,针对SIRT2 mRNA不同的靶序列设计并合成shRNA,构建真核表达干扰载体,制备慢病毒并感染HL60/A和NB4细胞,用嘌呤霉素筛选出稳定表达shRNA的细胞,应用蛋白质印迹法验证干扰效率;采用改良MTT法检测沉默SIRT2基因前后HL60/A和NB4细胞增殖的改变;用流式细胞术检测沉默SIRT2基因前后细胞周期的变化.结果 在HL60/A和NB4细胞中SIRT2蛋白表达水平均增高,F=43.22,P=0.002.用慢病毒感染HL60/A(F=184.9,P＜0.001)和NB4(F=354.7,P＜0.001)后,SIRT2基因的蛋白表达水平显著降低.MTT结果显示,与对照组细胞比较,48 h沉默SIRT2基因的HL60/A(F=208.4,P＜0.001)和NB4(F=27.58,P＜0.001)细胞的生长速度变慢;于72 h这种抑制作用更加明显,其中HL60/A的增殖速度明显变慢,F=555.9,P＜0.001.流式细胞术检测细胞周期结果显示,G0～G1期百分比,与对照组HL60/A/con(27.62±1.01)％相比,干扰组HL60/A/sh1 (37.14±0.03)％(F=7.61,P＜0.001)和HL60/sh2(37.51±3.63)％(F=3.89,P=0.009)比例显著增加;与对照组NB4/con(27.49±0.50)％相比,干扰组NB4/sh1(38.26±1.93)％(F=8.02,P=0.007)和NB4/sh2(35.23±1.11)％(F=3.50,P＜0.001)比例显著增加;S期细胞百分比,与对照组HL60/A/con(51.94±1.15)％相比,干扰组HL60/A/sh1 (40.24±0.66)％(F=3.34,P＜0.001)和HL60/sh2(42.73±2.76)％(F=10.33,P=0.004)比例显著降低;与对照组NB4/con(50.65±0.23)％相比,干扰组NB4/sh1(39.58±1.11)％(F=3.02,P＜0.001)和NB4/sh2(43.82±1.33)％(F=10.42,P=0.011)比例显著降低;G2～M期细胞比例无明显变化.结论 干扰SIRT2基因的表达可使细胞周期阻滞在G0～G1期,从而抑制急性粒细胞白血病细胞HL60/A和NB4的增殖.
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四硫化四砷对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4的凋亡作用
目的研究四硫化四砷对NB4细胞的促凋亡作用及这一过程中早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RARα) 融合基因及其表达产物的变化.方法通过细胞形态学观察, 流式细胞仪检测及DNA电泳等方法观察四硫化四砷对NB4细胞的诱导凋亡作用,用荧光染色体原位杂交技术, 反转录PCR及Western 印迹技术测定这一过程中PML-RARα融合基因及其表达产物的改变.结果四硫化四砷在0.5～3μmol·L-1之间能诱导NB4细胞凋亡,在此过程中,PML-RARα融合基因无明显变化,但PML-RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白的表达明显减少.结论四硫化四砷能诱导NB4细胞凋亡,其作用靶点可能在PML-RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白.
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丙烯酰胺诱导人白血病HL-60和NB4细胞hprt基因的分子突变谱
为了研究丙烯酰胺的遗传毒理作用，采用单细胞克隆培养，双向筛选计数，多重PCR扩增与电泳分析，研究了诱导HL-60和NB4两种细胞hprt基因突变率及分子突变谱. 发现只有丙烯酰胺高剂量组（700 mg*L-1）才对两种细胞有明确的致hprt基因突变作用；丙烯酰胺诱发突变主要由点突变和缺失两部分组成（40.0%～66.7%，33.3%～60.0%），而自发突变几乎全是点突变（90.0%以上），两种细胞均无全基因缺失型；缺失突变可以发生于hprt基因上的每个外显子（除外显子7/8以外），较集中于基因的3′末端，且诱发突变中绝大多数是点突变与单个外显子缺失（93.3%，86.1%），两种细胞情况类似. 结果提示，丙烯酰胺具有较弱的诱导hprt基因突变的作用，且诱发突变与自发突变的分子图谱不一样，这可能与其作用机理有关.
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人脐带间充质干细胞分泌白介素-6对白血病细胞分化的影响
目的 探讨脐带来源的间充质干细胞(UC-MSC)对白血病细胞分化的影响.方法 体外建立UC-MSC与急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞共培养体系,通过细胞形态、硝基四唑氮蓝还原实验和细胞表面粒系分化标志CD11b的柃测,评价肿瘤细胞的分化状态.结果 UC-MSC在体外能够诱导NB4细胞向粒系分化成熟并和小剂量全反式维甲酸共同应用时存在诱导作用联合增强.白介素(IL)-6Ra中和阻断IL-6作用后可部分逆转UC-MSC的促分化作用,外源性IL-6对NB4细胞发挥促粒系分化作用.结论 UC-MSC通过分泌IL-6可以诱导急性早幼粒细胞白血病细胞向粒系分化成熟,且和小剂量全反式维甲酸同时应用可以达到诱导分化作用联合增强.
关键词： 间充质干细胞 急性早幼粒细胞白皿病 NB4 分化 白介素-6 -
树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养增强其体内外抗肿瘤活性
目的探讨与树突细胞(DC)共培养能否增强正常人细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的体内外抗瘤活性.方法分别按照常规方法从正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将NB4白血病细胞冻融物(LCL)冲击或未冲击的DC与CIK细胞共培养(LCL-DC+CIK、DC+CIK),以CIK细胞单独培养作为对照.用流式细胞术分析细胞表型,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定分泌IFN-γ的细胞数,51Cr释放实验测定体外细胞毒活性,同时用NB4细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肿瘤活性和归巢情况.结果在培养第15天, LCL-DC+CIK与CIK细胞单独培养相比,增殖速率明显提高 [(18.2±2.1)倍vs(11.6±2.3)倍, P<0.05],CD3+CD56+ 表达水平也明显提高 [(51.05±2.63)% vs(30.18±1.45)%, P<0.05],分泌IFN-γ的细胞数量明显增高 [(86.33±5.51)/104细胞 vs(44.61±3.05)/104细胞, P<0.05],同时LCL-DC+CIK对NB4、K562、KG1a的体外细胞毒活性增强.体内实验显示与单独培养CIK细胞相比,LCL-DC+CIK细胞共培养后,可明显抑制接种瘤细胞裸鼠的成瘤率,提高裸鼠的长期无瘤存活率(100% vs 66.7%, P<0.05),以DiI标记的LCL-DC+CIK细胞在接种后7 d内可在脾脏、淋巴结及肿瘤局部被检测到.LCL-DC+CIK与DC+CIK细胞在抗瘤效应上没有明显差异.结论与DC共培养可使CIK细胞获得更高的增殖速率和更强的体内外抗肿瘤活性,可以作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.
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WT1基因表达模式改变对NB4细胞分化的影响
目的探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4分化的影响及其分子机制.方法用电穿孔法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的重组真核表达载体及其对照质粒pCB6+转导NB4细胞,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株.通过形态学观察,细胞周期动力学检测,NBT还原试验,细胞表面分化抗原CD11b的检测了解外源性WT1基因异构体WTA在全反式维甲酸(ATRA)诱导下对NB4细胞分化的影响.用RT-PCR检测细胞中PML/RARαt、p21、c-myc基因表达的改变.结果 ATRA处理细胞48 h,对照组(转染空载体的NB4/CMV和未转导WTA的NB4细胞)细胞分化明显,NB4/WTA细胞只出现部分分化.流式细胞术检测NB4/WTA细胞CD11b相对荧光强度(4.63±1.63)低于对照组(8.15±1.84),ATRA作用24 h后CD11b相对荧光强度(31.42±5.65)与对照组(71.95±9.36)相比差异更为明显.NB4/WTA细胞NBT还原能力较对照组下降,经ATRA处理后两组细胞之间的NBT还原能力的差异更加明显.RT-PCR提示NB4/WTA细胞PML/RARα、p21、c-myc基因的表达较对照组升高.结论增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由+17AA/+KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型能部分抑制ATRA对NB4细胞的诱导分化作用,这可能与PML/RARαt、p21、c-myc基因表达上调有关.
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丁酸钠诱导NB4细胞凋亡的蛋白质组学研究
目的分析丁酸钠(SB)诱导NB4细胞凋亡后细胞蛋白质组的变化,以探讨SB诱导NB4细胞凋亡的分子机制.方法在NB4细胞培养体系中,加入1.0 mmol/L SB,用流式细胞术检测对照组及加药后0,12,24,48,72 h细胞的凋亡情况;分别取对照组及用药后上述时间点的细胞进行双向凝胶电泳(2-DE),分析不同时间点蛋白质组的变化,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)对发生变化的蛋白质进行鉴定分析.结果SB可诱导NB4细胞凋亡,并呈时间依赖性.SB作用NB4细胞后21种蛋白发生了明显的变化,这些敏感蛋白涉及凋亡信号传导、免疫调节、转录调控、细胞代谢、细胞内分子转运等众多细胞内事件.其中13种蛋白已有报道与凋亡相关.结论SB不仅可促进肿瘤细胞凋亡,而且可能有增强细胞对化疗药物敏感性及免疫调节作用,新蛋白的鉴定为进一步分析SB抗肿瘤作用的机制及筛选新的药物靶点奠定了分子基础.
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应用RNA干扰技术抑制白血病细胞血管内皮生长因子基因表达及功能的研究
目的探讨用RNA干扰技术下调血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞生长的影响.方法设计3段分别针对VEGF第3～5外显子的短发夹状RNA(shRNA)并构建其表达载体,分别转染人白血病细胞株NB4,用实时定量PCR及Western blot方法观察3段shRNA对细胞内VEGF基因表达的影响.抗性筛选稳定抑制VEGF表达的永久细胞克隆,应用MTT法、甲基纤维素半固体培养法及细胞周期动力学检测了解VEGF基因缄默对白血病细胞生长的影响.结果成功构建分别携带3段shRNA及对照随机片段的重组质粒pGenesil-VR1,2,3和pGenesil-con,3种shRNA重组质粒中pGenesil-VR3可明显降低细胞内VEGF mRNA的丰度及VEGF蛋白表达,筛选出的NB4-VR3细胞株增殖能力明显下降,细胞集落形成率为(13.3±3.8)%,与NB4-con的(21.3±6.4)%和NB4组的(24.5±5.2)%相比,差异有统计学意义(P＜0.05),细胞周期阻滞于G1期,3组细胞G1期比例分别为(53.2±4.6)%、(42.7±5.9)%和(40.5±5.3)%.结论应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断VEGF基因表达及功能的shRNA,VEGF基因表达下调能明显抑制白血病细胞生长.
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胆固醇合成抑制剂洛伐他汀对NB4细胞体外作用的研究
目的研究胆固醇合成抑制剂洛伐他汀(Lovastatin,LOV)对NB4白血病细胞增殖、凋亡、分化的影响.方法以NB4白血病细胞为模型,用MTT比色法、锥虫蓝拒染法首先观察LOV对细胞增殖及活力的影响.通过细胞形态学观察、NBT还原试验、DNA凝胶电泳、流式细胞术细胞周期分析、TUNEL、RT-PCR半定量测定bcl-2 mRNA水平,系统观察LOV对NB4体外诱导分化和凋亡的情况.后利用RT-PCR半定量测定H、K、N-ras基因表达水平,结合流式细胞术进行胞膜p21Ras蛋白测定,探讨LOV作用机制.结果①LOV抑制NB4细胞增殖,IC50为12.59?μmol/L.②LOV诱导NB4细胞凋亡,影响细胞周期进程,细胞阻滞于G1/S期.LOV在诱导细胞凋亡过程中随作用时间延长,bcl-2表达水平逐渐下降.③LOV不影响NB4细胞分化.④LOV作用于NB4细胞,H、K、N-ras基因转录水平无变化,但膜表面p21Ras蛋白水平随时间进行性下降.结论 LOV抑制NB4细胞增殖并诱导凋亡,使细胞周期进程阻滞于G1/S期.bcl-2参与了LOV诱导NB4细胞凋亡的基因调控.LOV对NB4细胞分化无影响.p21Ras蛋白异戊二烯化受抑而阻滞p21Ras蛋白定位于细胞膜上可能是LOV影响NB4细胞的主要机制.
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槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究
目的探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位.方法经全反式维甲酸(ATRA)、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象,细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法;PML蛋白细胞内分布定位采用免疫荧光技术;PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法、结果①ATRA处理后,NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现,K562细胞无变化;经槲皮素处理后,各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变.②ATRA处理后,NB4细胞内融合蛋白降解,PML蛋白恢复定位,HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化;槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解,PML.蛋白聚积于POD结构,随后降解,在HL-60及K562细胞,PML蛋白发生相似改变.③ATRA、槲皮素对各组细胞PML mRNA表达均无显著影响.结论在不同诱导剂刺激下,PML基因在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制;PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用.
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转染VEGF-C cDNA对NB4细胞增殖、分化与凋亡的影响
目的探讨转染血管内皮生长因子(VEGF)-C cDNA对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞增殖、全反式维甲酸(ATRA)诱导分化及化疗药物介导的细胞凋亡作用的影响.方法采用脂质体法将重组表达载体(pcDNA3.1-VEGF-C)和pcDNA3.1转染NB4细胞建立稳定细胞株;采用MTT法及集落形成实验分析转染VEGF-C cDNA对NB4细胞增殖的影响;NB4/VEGF-C细胞经ATRA诱导后涂片经瑞特-姬姆萨染色作形态学分析,实时荧光定量PCR检测调控粒细胞分化基因C/EBPα相对表达水平,同时以流式细胞术检测细胞表面的CD11b表达量;Annexin V/PI双染流式细胞术检测NB4/VEGF-C细胞经鬼臼乙叉甙(Vp16)诱导的细胞凋亡;并以实时荧光定量PCR检测bcl-2基因相对表达水平,均以NB4/pcDNA3.1细胞为对照.结果成功转染获得稳定表达VEGF-C的细胞株NB4/VEGF-C,其增殖能力显著高于NB4/pcDNA3.1细胞;NB4/VEGF-C细胞对抗ATRA介导的早幼粒细胞分化成熟,CD11b表达量低于对照组,C/EBPα基因含量仅为对照组的1/32;NB4/VEGF-C细胞经Vp16介导后bcl-2基因表达约为NB4/pcDNA3.1细胞的2.28倍,而凋亡的NB4/VEGF-C细胞百分率(7.20±2.52)%明显低于凋亡的NB4/pcDNA3.1细胞的(16.07±3.58)%(P=0.005).结论VEGF-C通过VEGF受体3(VEGFR-3)信号途径促进白血病细胞增殖,抑制分化诱导剂介导的NB4细胞分化及化疗药物介导的细胞凋亡,推测VEGF-C/VEGFR-3信号途径在白血病疾病进展中发挥重要作用并可望作为白血病治疗的靶点.
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冈田酸对全反式维甲酸诱导NB4、MR2细胞分化的影响
目的 探讨丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OKA)对全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化的影响,探讨PP2A活性与白血病细胞ATRA耐药的关系.方法 用ATRA、OKA、ATRA+OKA分别作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞及其耐药细胞系MR2细胞,采用瑞特染色法和NBT还原实验观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞表面CD11b表达,丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶试剂盒检测细胞内PP2A活性,Western blot法检测细胞内PP2A各亚基表达.结果 ①细胞形态学、NBT还原实验及流式细胞术检测结果均显示,加入OKA抑制蛋白磷酸化酶活性能促进ATRA诱导的NB4细胞分化,并协同ATRA能诱导其耐药细胞MR2细胞发生部分分化.②酶活性分析显示,未处理的NB4细胞PPA活性为(959±83)pmol磷酸盐·min-1,μg蛋白-1;ATRA诱导NB4细胞分化过程中,PP2A活性明显下降[(534±43)pmol磷酸盐·min-1.μg蛋白-1],ATRA+OKA组PP2A活性下降更加明显[(229±23)pmol磷酸盐·min-1·μg蛋白-1];单用ATRA作用于MR2细胞,则PP2A活性无明显影响,而ATRA+OKA诱导MR2细胞分化中,PP2A活性下降.③Western blot.结果 显示,ATRA作用5d的NB4细胞中PP2A-C亚基表达较对照组明显减少,而A和B亚基表达与对照组比较变化不明显;在MR2细胞中,A、B和C亚基表达在处理组与对照组之间无明显差别.结论 ATRA诱导的NB4细胞分化过程中细胞内PP2A-C表达减少,PP2A活性降低.ATRA不能有效抑制MR2细胞内PP2A的活性,可能是MR2细胞对ATRA耐药的机制之一.
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姜黄素调节NB4细胞P53和组蛋白H3乙酰化抑制细胞增殖的研究
目的研究姜黄素对NB4细胞组蛋白H3和非组蛋白P53的乙酰化和细胞增殖的作用,探讨姜黄素抗白血病机制.方法应用不同浓度(50,25,12.5,6.25,3.125 μmol/L)的姜黄素作用NB4细胞不同时间(0,4,8,12,24 h),MTT法测定姜黄素对NB4细胞增殖的影响,Western blot法检测乙酰化组蛋白H3和乙酰化P53的水平.结果姜黄素以时间和剂量依赖方式抑制NB4细胞增殖,在24 h和36 h的IC50值分别为40 μmol/L和25 μmol/L;能明显上调组蛋白H3的乙酰化水平,促进P53的表达和P53的乙酰化.结论姜黄素具有去乙酰化酶抑制剂作用,能上调组蛋白H3乙酰化水平,促进肿瘤抑制因子P53表达和活化,抑制白血病细胞增殖.
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丹参酮ⅡA诱导NB4细胞凋亡与线粒体跨膜电位关系的研究
目的研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)诱导NB4细胞凋亡与线粒体跨膜电位(ΔΨm)关系.方法将NB4细胞分别用TanⅡA、As2O3、TanⅡA +1.0 μg/ml 环孢菌素A(CsA)和As2O3+1.0 μg/ml CsA处理,然后用光镜和透射电镜观察NB4细胞形态学变化;用流式细胞术分别测定亚G1期细胞百分率及PI和Rh123双染色后细胞的ΔΨm.结果 NB4细胞经1.0和2.0 μg/ml TanⅡA处理后的亚G1期细胞百分率无差异,但均高于0.5 μg/ml组.NB4细胞经TanⅡA作用后,光镜和透射电镜下观察到典型的凋亡形态学特征;随着TanⅡA作用时间增加,NB4细胞凋亡数增加和ΔΨm 降低(P<0.01),两者呈直线相关.CsA能抑制TanⅡA 诱导NB4细胞ΔΨm 降低和凋亡细胞数增加(P<0.01).结论 TanⅡA诱导NB4细胞凋亡是通过使线粒体膜通透性转运孔开放,ΔΨm降低来实现的;CsA能抑制这些效应.
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蓬子菜总黄酮诱导NB4细胞凋亡作用及机制
目的 观察蓬子菜总黄酮(FGVL)诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4)细胞凋亡作用,并探讨其作用机制.方法 FGVL(50、100、200μg/mL)作用于体外培养的NB4细胞,Hoechst染色观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡状况;RT-PCR检测NB4凋亡相关基因Mel-18、Sall4、Bmi-1 mRNA表达.结果 细胞形态学观察显示,NB4细胞经FGVL处理48 h后,与对照组比较,FGVL各剂量组NB4细胞凋亡比例均明显升高(P＜0.05),呈现细胞核固缩、核碎裂及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征;与对照组(2.3％)比较,50、100、200 μg/mL FGVL组NB4细胞凋亡率(分别为9.3％、13％、20.4％)明显升高(P＜0.05);细胞周期检测结果显示,与对照组比较,50、100、200 μg/mL FGVL组NB4细胞G0/G1期细胞比例(分别为43.92％、37.26％、29.15％)减少,S期细胞比例(54.16％、62.23％、70.46％)增多;与对照组比较,100、200 μg/mLFGVL组NB4细胞Mel-18 mRNA表达水平升高,Sall4、Bmi-1 mRNA表达水平明显降低.结论 FGVL可阻滞NB4细胞于S期,抑制细胞增殖,通过调节Mel-18、Sall4、Bmi-1等凋亡相关基因表达诱导细胞凋亡.
