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燕窝鉴别中的蛋白质电泳研究
目的:探讨SDS-PAGE和等电聚焦电泳应用于燕窝蛋白分离及燕窝鉴定中的可行性.方法:提取印尼燕窝、怀集燕窝及常作为伪品的明胶、银耳、猪皮的蛋白质,进行SDS-PAGE和等电聚焦电泳研究.结果:印尼燕窝与怀集燕窝在SDS-PAGE图谱上可见明显差异,而明胶、银耳和猪皮等伪品可见特征性蛋白条带.燕窝蛋白经等电聚焦电泳可见清晰的蛋白条带,且主要集中于酸性端.结论:SDS-PAGE和等电聚焦电泳均可获得燕窝蛋白质的特征性电泳图谱,用于鉴别不同品种燕窝及掺伪燕窝是可行的.
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一株产碳青霉烯酶IMP-26阴沟肠杆菌的分离鉴定
在过去的几年中,产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌不断被发现,这引起了临床工作者的强烈担忧.我院发现一株碳青霉烯类抗菌药物耐药的阴沟肠杆菌,此临床菌株分离自一位9个月的哮喘患儿,对亚胺培南和厄他培南表现为耐药,其低抑菌浓度分别为4 μg/ml和16μg／ml.对青霉素类,头孢类及头孢与酶的复合制剂都表现为耐药.进一步的实验显示此菌株的Hodge试验阳性,确定该菌株产碳青霉烯酶.通过对亚胺培南与亚胺培南+EDTA的纸片的抑菌圈直径的比较,发现此种碳青霉烯酶能被EDTA抑制.通过PCR扩增,发现此阴沟肠杆菌含有blaInt11、blaIMP和blaTEM基因,通过测序和比对确定blaIMr的基因型为blaIMP-26,balTEM基因的基因型为blaTEM-104.通过等电聚焦电泳,也证实此阴沟肠杆菌产IMP和TEM酶.
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不同银染法和上样模式对双向凝胶电泳影响的初步分析
双向凝胶电泳(2-DE)技术是蛋白质组学研究的重要支撑技术之一.该技术利用蛋白质2项独立物化参数--等电点(pI)和分子量的差异,将高分辨率的等电聚焦电泳(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)程序相组合.2-DE常用的标本上样方式有溶涨上样和杯上样.前者溶涨与等电聚焦同时进行,后者溶涨与等电聚焦依次进行.常用的下游蛋白质显示技术包括同位素标记法、荧光标记法、染料标记法、金属和重金属离子标记法.银染法属金属离子还原染色,分双胺银染法和非双胺化学显色银染法.本研究通过比较两种上样方式和两种银染法对人肝癌细胞系MHCC97H、97L的2-DE图谱的影响,以期建立较理想的实验室内2-DE相关技术的方法.
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非刺激性混合唾液等电聚焦电泳诊断舍格伦综合征的研究
目的 通过观察患者唾液蛋白成分的变化,探讨一种新的舍格伦综合征的诊断方法.方法 对28例经确诊的舍格伦综合征患者和16名健康正常人非刺激性混合唾液唾液进行等电聚焦电泳蛋白分离.使用激光光密度计扫描凝胶并以专业软件分析蛋白沉淀带.结果 舍格伦综合征患者和正常人电泳条带数目不同,分布形态不同,各条带蛋白含量有差异.本实验诊断舍格伦综合征的特异性为86%,敏感性81%,阳性预期符合率89%,阴性预期符合率76%.结论 非刺激性混合唾液等电聚焦电泳是一种可行的无创性诊断舍格伦综合征的方法.
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近效期重组人生长激素两种注射剂型的有关物质研究
目的:通过多种分析方法分析国内外两种剂型的近效期重组人生长激素(rhGH)有关物质的组成和含量.方法:采用2010版《中华人民共和国药典》二部rhGH各论下的分子排阻色谱、反相色谱及等电聚焦电泳等方法,结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对16批注射用rhGH及3批rhGH注射液进行了高分子蛋白质及有关物质的分析.结果:2种剂型rhGH高分子蛋白的含量及增长模式较为相近,效期结束时增加了约1倍,而总有关物质特别是脱酰胺rhGH的含量则有较大差异.注射用rhGH的总有关物质含量增长了约1.5倍.国内企业近效期rhGH注射液的总有关物质含量增长了约5倍,而国外企业增长了约9倍,均接近或超过注射用rhGH相关物质13.0％的限值,其中主要的有关物质为脱酰胺rhGH.结论:rhGH在液态剂型中更容易产生有关物质.
关键词： 重组人生长激素 脱酰胺重组人生长激素 等电聚焦电泳 有关物质 -
耐头孢西丁肺炎克雷伯菌的耐药监测及其β内酰胺酶研究
目的对头孢西丁耐药的肺炎克雷伯菌进行耐药性监测,并对所产的β内酰胺酶进行初步研究.方法用琼脂稀释法测定所选菌株对13种常用抗生素的低抑菌浓度(MIC),对菌株粗提酶进行等电聚焦电泳和三维试验.结果⑴所测的13种抗生素中,亚胺培南和美洛培南100%敏感,其次头孢吡肟的耐药率较低,为20.6%,头孢噻肟的敏感性高于头孢他啶.⑵等电聚焦电泳发现:绝大部分菌株都有多条β内酰胺酶条带,等电点为5.4和7.8的条带多见.⑶三维试验结果:超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的产生率为79.5%,AmpC酶(Ambler C型)的产生率为41.0%,同时产ESBLs和AmpC酶的产生率为35.9%.结论头孢西丁耐药的肺炎克雷伯菌大部分菌株同时产两种甚至多种β内酰胺酶,临床微生物实验室应加强对此类菌株所产的β内酰胺酶特别是AmpC酶的监测和研究.
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SHV-59型β-内酰胺酶的克隆与表达
目的 构建SHV-59型β-内酰胺酶的表达载体.方法 抽提菌株的质粒,应用PCR扩增SHV-59基因全长编码序列,扩增产物经Nde Ⅰ、Xho Ⅰ酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点(PI).结果 PCR扩增获得879 bp的产物,重组表达载体经Nde Ⅰ、Xho Ⅰ酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,表明载体[pET-26b(+)/SHV-59]构建成功.目的等电点为7.6.结论 β-内酰胺酶SHV-59在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件.
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OKP-B-13型β-内酰胺酶的克隆与表达
目的 构建OKP-B-13型β-内酰胺酶的表达载体.方法 抽提菌株的质粒,应用PCR扩增OKP-B-13基因全长编码序列,扩增产物经Nde Ⅰ、Xho Ⅰ酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTC诱导表达.超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点(pI).结果 PCR扩增获得879 bp的产物,重组表达载体经Nde ⅠXho Ⅰ酶切及DNA测序后表明,目的 基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体[pET-26b(+)/OKP-B-13]构建成功.目的 等电点为7.1.结论 β-内酰胺酶OKP-B-13在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件.
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两种粉螨的酯酶同工酶和相关蛋白质电泳的研究
目的探讨粉螨的酯酶同工酶和相关蛋白质在分类及生化遗传学上应用价值.方法应用等电聚焦电泳(IEFE)研究腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)和粉尘螨(Dermatophagoides farinae)的酯酶同工酶和蛋白质,并将两者进行了比较.结果腐食酪螨的酯酶同工酶可见8条带,分布在pH3.62～5.20范围内,第2,6条明显深染,为主带;粉尘螨的酯酶有7条带,分布在pH4.68～5.42范围内,可见3条主带;腐食酪螨和粉尘螨蛋白质均出现22条带,但腐食酪螨有2条特别明显的深染主带,粉尘螨可见3条明显深染主带.结论两种粉螨的酯酶同工酶及相关蛋白质的电泳谱可在一定程度上反映出科、属、种的差别,酯酶同工酶具多态性,可应用于种属鉴定和遗传变异的探讨.
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等电聚焦电泳/免疫固定和考马氏蓝染色技术检测缺糖转铁蛋白
目的建立等电聚焦电泳/免疫固定(IEF/IF)和考马氏蓝染色技术检测缺糖转铁蛋白(CDT)方法.方法 选择32例酒精性肝病患者,血清铁饱和后,进行水平板式超薄层等电聚焦电泳,免疫固定和考马氏蓝染色后,蛋白条带进行等电点分析.结果酒精性肝病组CDT阳性率为87.5%.CDT诊断酒精性肝病的灵敏度为87.5%,特异度为69.39%.结论 IEF/IF结合考马氏蓝染色技术是一种操作方便、经济、灵敏度高、分辨率高、适用于进一步大样本检测血清CDT的方法.
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革兰阴性杆菌中超广谱β-内酰胺酶的检测
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是革兰阴性杆菌对广谱头孢菌素以及单环β-内酰胺类抗生素产生耐药的重要机制之一.缺少可靠的检测方法是造成产ESBLs细菌广泛流行的原因之一.人们探索了许多方法,如双纸片、E-test、等电聚焦电泳等方法.本文对目前应用的检测ESBLs的大部分方法作了综述.
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阳离子DNA抗体与狼疮肾炎的关系
为研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血阳离子抗体与狼疮肾炎的关系,本文采用制备型等电聚焦电泳、放射免疫测定及SDS-PAGE电泳等方法对SLE肾炎患者及无肾炎患者外周血清中阳离子dsDNA抗体进行了分离和检测分析,结果表明,在SLE肾炎患者外周血清中存在着高滴度的dsDNA抗体,而无肾炎患者则不存在这种抗体,说明阳离子dsDNA抗体SLE肾炎的发病相关.
关键词： SLE 阳离子dsDNA抗体 等电聚焦电泳 -
三种聚丙烯酰胺凝胶提纯电泳在蛋白质提纯中的应用
目的探讨3种聚丙烯酰胺凝胶提纯电泳在蛋白质提纯中的应用.方法用普通聚丙烯酰胺凝胶提纯电泳(PAGE)、等电聚焦提纯电泳(IEF)和等速提纯电泳(ITP)对样品进行分离.结果 3种提纯电泳均可分离蛋白质.PAGE的区带分辨率低,加样量不高;IEF的区带分辨率高,可分离同种蛋白的亚成分,加样量小;ITP区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量大.结论低离子强度提纯电泳是可行的,分离效果令人满意.
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脑脊液寡克隆区带检测联合IgG指数在中枢神经系统疾病诊断中的意义
目的:探讨脑脊液寡克隆区带(oligoclonalbands,OCB)检测联合IgG指数对中枢神经系统疾病的临床诊断意义.方法:选取38例中枢神经系统炎性疾病患者和43例同期非中枢神经系统疾病患者(对照组),取其脑脊液和血清标本,应用等电聚焦电泳检测OCB,免疫散射比浊法计算IgG指数,并进行比较分析.结果:中枢神经系统炎性疾病组中,多发性硬化、吉兰巴雷综合征、视神经脊髓炎、急性脊髓炎、病毒性脑炎及其他中枢神经系统炎性疾病患者的脑脊液OCB阳性分别为11例(11/13)、2例(2/9)、1例(1/3)、2例(2/5)、0例(0/5)及3例(3/3),而对照组的脑脊液OCB均为阴性.中枢神经系统炎性疾病各亚组的IgG指数均有高于对照组的趋势,但仅多发性硬化组(1.34±1.65)与对照组(0.54±0.36)间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论:检测患者脑脊液OCB并计算IgG指数,可用于了解其内源性免疫球蛋白IgG的合成情况,对中枢神经系统疾病的诊断具有一定的辅助价值.
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SHV-28型β内酰胺酶的原核表达及其性质鉴定
目的:获得SHV-28型β内酰胺酶蛋白,并研究其特性.方法:将SHV-28型β内酰胺酶基因连接到pET-28b载体上,重组质粒pET-28b/SHV-28转化大肠埃希菌BL21(DE3).用酶抑制剂增强的纸片扩散法检测重组菌的表型,等电聚焦电泳测定其表达蛋白的等电点.结果:SHV-28型β内酰胺酶的等电点为7.6,为非超广谱β内酰胺酶.结论:SHV-28型β内酰胺酶蛋白表达正确,为进一步研究新基因型β内酰胺酶奠定了基础.
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大规模牛血红蛋白提取方法的研究
建立了适合中国国情的大规模牛血红蛋白（Hb）的提取和纯化方法，为血液替代品的研究和生产提供原料保障。通过建立水性两相系统提取法、乙酸锌沉淀提取法、CO饱和提取法和板框过滤结合脱氧加热提取法，比较了用不同方法提取的牛Hb的纯度和牛Hb中所含的metHb、HbCO和HbO2的含量。板框过滤结合脱氧加热提取法对器材要求不高，便于产业化，适合于为血液替代品的研究和生产提供合格的原料。
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优化等电聚焦电泳方法评价重组人红细胞生成素质量
目的 对等电聚焦电泳(IEF)分析方法进行优化,以更好地评价重组人红细胞生成素(rHuEPO)产品的质量.方法 用优化的IEF方法分析rHuEPO异构体分布,同时参照rHuEPO的体内外生物学活性和唾液酸含量结果,综合评判rHuEPO的质量.结果 建立的优化等电聚焦电泳方法分析rHuEPO,图谱清晰,检测结果可靠.结论 IEF方法的优化为rHuEPO的质量控制提供了快捷,准确的手段.
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浙江省天南星族药用植物新鲜块茎的等电聚焦电泳分析
目的:为天南星族药用植物的分类和鉴定提供依据.方法:以聚丙烯酰胺/凝胶等电聚焦电泳(IEF)方法对天南星族植物7种4变种1变型18个样品蛋白质进行分析.结果:不同属植物的电泳谱之间有明显差异.结论:利用IEF谱带差异可准确地区分犁头尖属、半夏属和天南星属.
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斯氏狸殖和丰宫并殖吸虫成虫乳酸脱氢酶同工酶等电聚焦电泳的比较研究
目的通过对云南省斯氏狸殖吸虫(Pagomogonimus skrjabini Chen.1959)和丰宫并殖吸虫(Paragonimus proliferus.1964)成虫乳酸脱氢酶(LDH)的比较研究,为吸虫的分类及定种提供科学依据方法采用丙烯酰胺凝胶圆盘等电聚焦电泳,对乳酸脱氢酶同工酶进行分离,并采用底物特一性染色法进行确定电泳结果.结果两虫种成虫乳酸脱氢酶同工酶谱分析,结果发现二者均显示5条酶带,其中斯氏狸殖吸虫的LDH有3条优势酶带(LDH1、LDH2、LDH3)而丰宫并殖吸虫的LDH仅有2条优势酶带(LDH1、LDH2);对各成分的等电点及相对迁移率进行计算,发现丰宫并殖吸虫与斯氏狸殖吸虫间存在生化指标的差异,同时也发现两虫种间具有一共同性质的LDH4.结论通过对两虫种同工酶谱的分析可知,它们之间具有一定的亲源性,但二者间又有同工酶谱的差异性,因此乳酸脱氢酶同工酶谱的分析可为并殖吸虫的分类提供生化依据和指标.
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LEN-5型β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达
目的 对来自肺炎克雷伯菌临床菌株的LEN-5型β-内酰胺酶进行基因克隆和重组表达.方法 从相应临床菌株提取质粒DNA;以质粒为模板,PCR扩增LEN-5基因,扩增产物经Nde I、Xho I酶切后连接至pET-26b (+)表达载体,重组质粒经DNA测序确证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达.超声破碎法提取蛋白表达产物,头孢硝噻吩检测其活性,并检测蛋白的等电点(pI).结果 PCR扩增获得879bp的产物,DNA序列显示该片断序列与目的 序列完全一致.重组表达载体经Nde I、Xho I酶切及DNA测序后表明,目的 基因已成功接入表达载体,表达产物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体[pET-26b(+)/LEN-5]构建成功.表达蛋白的等电点为7.6.结论 β-内酰胺酶LEN-5基因在原核细胞中完成了重组和表达,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础.
