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999感冒灵主要药效学及其作用机制研究
观察999感冒灵全方中中药组分与化学药组分配伍后在药效学作用上的协同作用,并研究其作用机制.分别在冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠胸膜炎非特异性炎症模型和酵母菌致大鼠发热模型和肺炎克雷白杆菌细菌生物被膜(Klebsiellar pneumonia,KPN)模型上,比较感冒灵全方、化学药组分和中药组分的抗炎、解热作用的异同.结果显示,与模型组比较,感冒灵全方组小鼠伊文思蓝渗出量明显减少,小鼠的耳肿胀度明显减小,化学药组分和中药组分组均未见显著性差异;感冒灵全方组、化学药组分组、中药组分组大鼠胸腔渗出液TNF-α和IL-1β浓度明显降低,感冒灵全方组大鼠血清TNF-α,IL-1β和IL-8,化学药组分组大鼠血清TNF-α,IL-8和中药组分大鼠血清IL-8浓度明显降低;感冒灵全方组和化学药组分组大鼠分别于药后4～8h体温升高值明显减小,中药组分组大鼠的体温升高值无明显差异.感冒灵全方在55～13.75 g·L-1、中药组分在45 ～22.5 g·L-1、西药组分在10g·L-1时可显著降低细菌生物被膜的活菌量.扫描电镜显示,感冒灵全方(55 g· L-1)和西药组分(10g·L-1)可破坏KPN生物被膜,中药组分(45 g·L-1)可在一定程度上破坏KPN生物被膜.结果表明,感冒灵全方具有明显的抗炎和解热作用,对成熟KPN生物被膜具有破坏作用.感冒灵化学药组分和中药组分在抗炎和抑制成熟KPN生物被膜内活菌量方面显示明显的协同作用,但在解热方面未观察到明显的协同作用.
关键词： 999感冒灵 炎症 炎性因子 肺克雷白杆菌(KPN) 细菌生物被膜 -
嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜的鉴定及其耐药性研究
目的 研究临床常用8种抗菌药物对嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia,SMA)体外生物被膜(bacterial biofilm,BBF)的抗菌活性. 方法 通过微量接种针装置建立SMA生物被膜的体外模型,测定左氧氟沙星、环丙沙星、哌拉西林、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、磺胺甲基异噁唑、庆大霉素和红霉素对SMA生物被膜的抑制浓度(biofilm inhibitory concentration,BIC),并与相应低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行比较.结果 共有42株SMA利用微量接种针成功建立成熟生物被膜的体外模型,8种抗菌药物对形成物被膜SMA的BIC50分别为左氧氟沙星4 μg/ml、环丙沙星8 μg/ml、哌拉西林256μtg/ml、头孢哌酮/舒巴坦128 μg/ml、头孢他啶128 μg/ml、磺胺甲基异噁唑304 μg/ml、庆大霉素256 μg/ml、红霉素128 μg/ml,相应抗生素的MIC50分别为0.25、2、64、16、32、19、32和32μg/ml.相应的BIC90也均高于MIC90.扫描电镜观察细菌培养24 h可形成成熟的生物被膜形态结构. 结论 与浮游态细菌相比,形成生物被膜后SMA对抗菌药物的耐药程度增加.
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大肠杆菌qseC基因敲除及其缺陷株生物被膜形成的研究
目的 通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株,并探讨qseC基因对大肠杆菌生物被膜形成的影响.方法 PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化人大肠杆菌MC1000,在Red同源重组酶作用下,用含同源臂的氯霉素抗性片段置换目的基因qseC,并利用FLP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.结晶紫染色半定量法分析qseC基因缺失株生物被膜形成能力的变化.结果 PCR及DNA测序结果表明,qseC基因已被成功敲除.在LB培养基中,qseC基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异.MC1000与MC1000 △qseC基因缺失株生物被膜形成能力半定量A值的结果分别为1.00±0.15和0.47±0.10.结论 成功构建大肠杆菌qseC基因缺失突变株,且qseC基因对细菌生物被膜的形成具有调控作用.
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肾上腺素对生物材料表面大肠埃希氏菌qseC缺陷株生物被膜形成的影响
目的 探讨肾上腺素( EPI)对生物材料表面大肠埃希氏菌 qseC 缺陷株生物被膜形成的影响.方法 以大肠杆菌MC1000、MC1000△qseC为实验菌株,对两菌株在不同培养基(LB或LBEPI)中的运动能力进行比较;同时分别将两菌株和PVC材料片在不同培养基(LB或LB+EPI)中培养,用激光共聚焦显微镜(CLSM)和扫描电镜(SEM)观察EPI对PVC表面细菌生物被膜形成的影响.结果 在LB培养基中,qseC缺陷株的细菌生物被膜形成能力较野生菌株明显减弱(P＜0.05).MC1000菌株在LBEPI培养基中的运动力较之在LB培养基中明显增强(P＜0.05),而qseC缺陷株的变化不明显.CLSM和SEM对PVC表面细菌生物被膜的检测结果表明,EPI增强MC1000菌株生物被膜形成能力,而对qseC缺陷株的影响不大.结论 肾上腺素促进大肠埃希氏菌在生物材料表面细菌生物被膜的形成,该作用由qseC介导.
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表皮葡萄球菌生物被膜结构观察
随着生物材料被广泛应用于临床,表皮葡萄球菌已经成为医院感染的主要条件致病菌.生物材料表面细菌生物被膜(biofilm,BF)的形成是导致感染反复发作及久治不愈的根本原因,且常常引发灾难性的后果[1].本研究通过建立医用生物材料聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PCV)表面表皮葡萄球菌BF体外模型,观察PVC材料表面细菌BF的结构,为生物材料植入感染研究提供实验模型和方法.
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体外建立及扫描电镜观察腹膜透析留置管大肠杆菌生物被膜模型
细菌生物被膜(biofilm,BF)是指细菌吸附于惰性物体如生物医学材料或机体黏膜表面后,分泌多糖基质将细菌体克隆聚集缠绕其中形成的膜样物.腹膜透析(PD)是慢性肾功能衰竭尿毒症期患者肾脏替代治疗的方式之一.腹膜炎是腹膜透析患者的严重并发症之一,大肠埃希菌是导致腹膜炎的常见G-菌.细菌从腹膜透析的导管出口部位侵入并可在透析液中繁殖能够在腹透管上成长为小菌落生物膜,腹膜透析病人中这些细菌及菌膜与反复发作性腹膜炎可能有关.本研究拟以腹膜透析管为载体,建立体外静置BF模型;然后采用银染法鉴定,扫描电镜观察BF形成能力,为寻找大肠杆菌BF相关感染的治疗方法并提供临床参考,以便制定出相应防治策略对于改善腹膜透析患者预后具有重要意义.
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铜绿假单胞菌耐药性在生物被膜形成过程中的变化
目的研究铜绿假单胞菌遗传性耐药(gyrA基因突变和MexAB-OprM主动外排)在生物被膜形成过程中对药物抗性的作用. 方法通过PCR技术鉴定gyrA基因突变株和MexAB-OprM主动外排株,利用三亲杂交的方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转到铜绿假单胞菌药物敏感株中,测定gyrA基因突变株、MexAB-OprM主动外排株以及带有绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌在特氟隆上产生生物被膜耐药的规律. 结果筛选出gyrA基因突变株和MexAB-OprM主动外排株.通过三亲杂交成功构建了带有pGFPuv质粒的铜绿假单胞菌.将突变株和敏感株培养在低杀菌浓度(MBC)的环丙沙星溶液中形成生物被膜使菌株的存活率均在50%以上. 结论比较遗传性耐药和生物被膜耐药的作用表明gyrA基因突变和主动外排在生物被膜耐药形成前期发挥主要作用,当生物被膜完全形成之后,铜绿假单胞菌的耐药性有可能是由生物被膜介导的.
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eDNA水平差异对表皮葡萄球菌临床株生物被膜形成能力的影响
目的 检测表皮葡萄球菌(表葡菌)临床株生物被膜的形成能力,研究胞外DNA(eDNA)水平差异对表葡菌临床株生物被膜形成能力的影响.方法 收集227株临床分离表葡菌,黏附试验检测其生物被膜的形成能力,PCR方法扩增icaA基因片段,黏附试验阳性和icaA基因扩增阳性的表葡菌为成膜组,黏附试验阴性和icaA基因扩增阴性的表葡菌为非成膜组,应用浮游培养法和微量板静置培养法检测eDNA水平,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察生物被膜中eDNA的分布.结果 227株表葡菌中黏附试验阳性26株,icaA基因阳性32株.选取黏附试验阳性和icaA基因扩增阳性的成膜组表葡菌20株,黏附试验阴性和icaA基因扩增阴性的非成膜组表葡菌19株,浮游培养2、4、6h后,成膜组菌株的eDNA水平分别为(32.2±10.1) μg/ml、(33.6±11.9) μg/ml、(34.3±10.0)μg/ml,非成膜组菌株的eDNA水平分别为(28.7±8.9)μg/ml、(31.5±11.7) μg/ml、(31.8±l2.7)μg/ml,浮游培养成膜组菌株各时相eDNA水平分别高于非成膜组菌株,但差异尚无显著性(P＞0.05).微量板静置培养法成膜组20株eDNA水平为(740.0±264.4) ng/A600,高于非成膜组19株eDNA水平(80.1±31.1) ng,/A600,两组之间比较差异具有显著性(P＜0.05).通过AO-PI荧光染色于CLSM下观察静置培养的成膜株表葡菌Y36,其生物被膜中可见eDNA分布；非成膜株Y26没有生物被膜结构形成,未见eDNA分布.结论 表葡菌临床株具有形成生物被膜的能力,eDNA是表葡菌形成生物被膜的重要基质成分,在判断表葡菌生物被膜形成能力方面微量板静置培养法检测eDNA水平优于浮游培养法.
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铜绿假单胞菌生物被膜引起小白鼠病理变化的动物实验
日本学者小林在1990年提出生物被膜病，认为能形成生物被膜的细菌在自然界广泛存在，对抗生素抵抗性很强。所以它在感染性疾病的治疗中已受到临床关注。细菌生物被膜至今仍难以清除，成为临床医学亟待解决的课题。本文对悬浮铜绿假单胞菌和生物被膜铜绿假单胞菌引起小白鼠的病理变化进行了观察。 6周龄，体重20～30克，雄性清洁级小白鼠分别用生物被膜状态的铜绿假单胞菌和悬浮铜绿假单胞菌在气管内接种，然后在接种后的不同时间观察相应的组织病理学改变。
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霍乱弧菌生物被膜
霍乱弧菌是烈性肠道传染性腹泻病--霍乱的病原体.细菌生物被膜(也译为生物膜,bacterial biofilm)是一种细菌附着于无活力或活组织表面、由其自身产生的聚合基质包裹、有结构的细菌细胞群体.
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42株形成生物被膜的嗜麦芽窄食单胞菌的药物敏感性研究
目的 研究单独及联合使用不同种类抗生素对嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmahophilia,SML)体外生物被膜的抗菌活性. 方法 收集从患者分离的非重复SML 42株,分别采用微量接种针和硅胶膜片在水解酪蛋白肉汤中构建细菌生物被膜(bacterial biofilm)的体外模型,经过抗生素(左氧氟沙星、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、哌拉西林、红霉素、磺胺甲噁唑、庆大霉素)作用20 h,超声振荡并测定孵育前后6 h吸光度(A)值的变化,计算相应的细菌生物被膜抑制浓度,进而测定红霉素与左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林对细菌生物被膜的联合作用. 结果 SML对左氧氟沙星、磺胺甲噁唑和哌拉西林敏感率分别为83.33%、66.67%和54.76%,其他抗生素的耐药率均在50%以上.形成生物被膜后,细菌对抗生素的生物被膜抑制浓度大于相应的小抑菌浓度(MIC)值. 结论 42株SML呈现多重耐药现象,形成生物被膜后耐药性增强.左氧氟沙星的抗菌活性在形成生物被膜前后均优于其他抗生素,联合红霉素与左氧氟沙星有助于增强杀菌效果.
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细菌生物被膜与导管相关血流感染的关系
在日常医疗实践中,尤其是在重症加强治疗病房(ICU),中心静脉导管,血管内置管等已成为进行血流动力学监测、血液净化、安全输液及静脉营养支持等主要的途径.然而,随之产生的导管相关性血流感染也日益突出,其可致患者住院时间延长,病死率增加,医疗负担加重[1-3].研究表明,细菌在上述导管表面形成生物被膜(biofilm,BF)并常对抗菌药物耐药,是细菌BF相关感染控制困难的重要原因[4].本文对细菌BF的概念、形成机制、作用、与导管相关血流感染的关系及其防治策略进行综述,以期对临床有所裨益.
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生物被膜大肠杆菌β内酰胺酶活性的检测
目的探讨生物被膜大肠杆菌的耐药机制.方法用改进的平板培养法建立大肠杆菌生物被膜模型,用扫描电镜进行鉴定.分别检测浮游大肠杆菌(A组)、生物被膜大肠杆菌(B组)及亚胺培南(C组)和头孢西丁(D组)诱导后生物被膜大肠杆菌产β内酰胺酶的活性.结果生物被膜大肠杆菌产β内酰胺酶是浮游大肠杆菌的2.16倍,经亚胺培南和头孢西丁诱导后生物被膜大肠杆菌β内酰胺酶的活性分别是生物被膜大肠杆菌的1.30倍和1.05倍.结论生物被膜大肠杆菌耐药与产生β内酰胺酶有关.
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呼吸机相关肺炎的发病机制
呼吸机相关肺炎(VAP)的发病机制与多种因素有关,主要包括呼吸道与全身防御机制受损, 口咽部定植菌"误吸” (aspiration), 胃、十二指肠定植菌逆行和易位,吸入(inhalation),细菌生物被膜(biofilm;BF)形成等[1].
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气管导管局部用药对生物被膜形成及医院内下呼吸道感染的影响
呼吸机相关肺炎(VAP)是机械通气(MV)患者常见并发症,是导致其病死率增加、住院时间及费用增加的主要原因,而部分患者并发的医院内气管支气管炎(NTB)可能是发生VAP的前奏[1].MV患者在气管导管(ETT)内形成的细菌生物被膜(BF)是VAP的重要致病菌来源之一,有关抑制ETT-BF形成而降低BF相关感染的研究多处于临床前阶段.因此,我们从临床出发研究了ETT局部涂布大环内酯类和喹诺酮类混合制剂的方法对MV 14日内ETT-BF形成以及对VAP和NTB的影响.
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细菌生物被膜耐药屏蔽及其防治
细菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)是细菌为适应自然环境有利于生存而特有的生命现象.BBF广泛存在于自然界,国外关于BBF研究是从研究细菌在建筑通水管道、河床吸附而形成BBF导致水源污染开始的.现代医学材料和许多慢性细菌感染性疾病的器官组织表面均发现BBF的存在.
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细菌的群体感应系统
感染性疾病是临床为常见也是难解决的疾病,抗生素是治疗感染的主要手段.抗生素的广泛使用,使得耐药率持续增加,感染成为人们面临的一种越来越难治疗的疾病.当细菌以群体形式存在时,如细菌生物被膜的产生,可使得细菌的生长模式、代谢状态和耐药性发生显著的变化,是造成难治性医院感染的主要原因.
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细菌生物被膜相关感染的致病机制及药物治疗
20世纪70年代,Costerton等提出了细菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)的概念并指出许多细菌以BBF形式广泛存在于自然界中.随着有关BBF的研究不断深入,越来越多的研究结果表明BBF与感染性疾病有密切的关系,美国疾病控制和预防中心(CDC)的研究结果表明,约65%的感染性疾病与BBF有关[1] .笔者于90年代起在国内开始了有关于BBF的实验研究,目前有关BBF的基础及临床研究越来越受到重视,现结合国内外研究进展概述如下.
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川贝母对大肠埃希菌生物被膜的影响研究
目的 探讨川贝母对大肠埃希菌生物被膜(BBF)的影响.方法 收集临床分离的大肠埃希菌株60株,根据药物敏感实验分为药物敏感组、单耐药组、多耐药组各20株,每株细菌分为未加川贝母的对照组和加川贝母的实验组,银染法观察其BBF形成面积;激光共聚焦显微镜法(CLSM)测定其BBF厚度;同时采用扫描电镜观察对照组和实验组细菌形态以及BBF结构改变.结果 药物敏感组:银染法对照组与实验组BBF积分分别为(2.60 ± 1.60)分及(2.65 ± 1.50)分,差异无统计学意义,CLSM法BBF厚度(μm)分别是(28.06 ± 4.36)μm及(27.13 ± 4.15)μm,差异无统计学意义;单耐药组:银染法对照组与实验组BBF积分分别为(3.85 ± 2.13)分及(3.10 ± 2.01)分,CLSM法BBF厚度分别为(33.34 ± 4.96)μm及(29.75 ± 4.96)μm,差异无统计学意义;多耐药组:银染法对照组、实验组BBF积分分别为(8.50 ± 2.16)分及(4.50 ± 3.02)分,CLSM 法BBF厚度分别为(51.87 ± 15.58)μm及(35.74 ± 12.79)μm,差异有统计学意义(P<0.05),其中川贝母干预效果明显的实验菌株,经扫描电镜观察发现实验组BBF膜样物较对照组明显减少.结论 川贝母对多耐药组细菌生物被膜形成有一定抑制作用.
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细菌生物被膜对大肠埃希菌多药耐药的影响
目的 探讨细菌生物被膜(Bacterial biofilm,BBF)对大肠埃希菌多药耐药的影响.方法 收集2014年1月-2014年5月临床分离的大肠埃希菌108株,经23种抗菌药物药敏试验分离出多药耐药菌株63株,其中耐三类药物组10株、耐四类药物组26株、五类及以上耐药组27株.对各组菌株分别采用扫描电镜(SEM)、银染法、激光共聚焦显微镜(CLSM)方法进行细菌生物被膜检测.SEM、银染法检测BBF面积,CLSM检测BBF厚度.对SEM和银染法结果进行组织化学评分(H-score).结果 SEM法与银染法耐三类药组、耐四类药组和耐五类及以上组BBF积分为(3.75±2.65)、(7.85±3.14)和(8.37±2.72)分与(4.13±3.60)、(7.61±2.94)和(8.13±3.07)分,三组两种方法的数据差异有统计学意义(P＜0.05),同种方法三组间差异有统计学意义(P＜0.05);而三组CLSM法BBF厚度分别为(35.67±6.01)、(46.73±9.55)、(52.38±13.81)μm,三组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BBF形成面积和厚度影响了细菌的多药耐药;随耐药种类的增多,耐药机制更为复杂,BBF影响力相对降低.
