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逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用
建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.
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化学合成siRNA抑制H5N1亚型禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞中的增殖
为研究RNA干涉对H5N1亚型禽流感病毒的增殖抑制作用,针对H5N1亚型禽流感病毒的NP和PA基因,设计4对siRNA干涉序列,并将其转染到鸡胚成纤维细胞,6h后接种H5N1亚型禽流感病毒液,在病毒感染后的16～56h内测定细胞上清中的病毒血凝价及观察细胞病变,并在病毒感染36h后检测NP、PA、HA和β-actin基因的mRNA水平.结果显示4对siRNA均能不同程度地抑制H5N1亚型禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞中的增殖,但以PA为靶基因设计的一对干涉序列效果优；实验还证实随着时间的延长,干涉效应逐渐减弱.本实验为研究RNA干涉技术防控禽流感提供了依据.
关键词： siRNA H5N1亚型禽流感病毒 鸡胚成纤维细胞 增殖 -
H5N1亚型禽流感病毒抗原成份免疫活性的分析研究
目的 分离H5N1亚型禽流感病毒抗原成份并分析其免疫活性.方法 本研究采用SDS-PAGE和Western-blot这两种方法对H5N1亚型禽流感病毒的抗原成份进行分离分析.结果 我们发现该病毒主要有14种多肽成份,其中有有11种蛋白组成成份被禽流感多克隆阳性血清特异性识别,经免疫酶联反应后,在醋酸纤维膜上可以清晰看到棕色的条带.结论 在14种H5N1亚型禽流感病毒蛋白中有11条具有抗原性和免疫活性.
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北京市首例人感染高致病性禽流感患者院内感染的预防
截至2009年3月30日,世界卫生组织公布的2003年以来全球实验室确诊的人感染H5N 1亚型禽流感病毒患者413例,死亡256例,病死率超过60%[1] ,由于人类对H5N1亚型禽流感病毒普遍缺乏免疫力,感染后病死率较高,WHO认为此病可能是使人类存在潜在威胁大的疾病之一[2] .
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H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白研究进展
禽流感(avian influenza ,AI) 为A型流感病毒(avian influenza virus ,AIV)引起的禽类流行性感冒.根据是否引起流感及症状的不同,通常将禽流感分为高致病性(highly pathogenic avian influenza,HPAI)、低致病性(low pathogenic avian influenza,LPAI) 和非致病性禽流感(no pathogenic avian influenza,NPAI).
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禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用
根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank: DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.
关键词： H5N1亚型禽流感病毒 HA基因 定点突变 表达 -
H5N1亚型禽流感病毒对小鼠致病性的研究
目的用一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠,观察其对小鼠的致病性及在小鼠间的传染性.方法将小鼠分为正常组、攻毒组、同居组,攻毒组乙醚麻醉后滴鼻感染AIV,观察各组食欲、反应、呼吸及有无皱毛、弓背、死亡等,测量体温及体重;检测相应抗体水平、小鼠排毒情况及小鼠各器官带毒情况,并观察病理组织学变化.结果攻毒组出现食欲反应下降,呼吸急促,皱毛,死亡;体重、体温下降.同居组未出现感染.攻毒组攻毒后12 h至第9天可从肺组织分离出病毒,第10天始出现相应抗体;感染小鼠的肺、心肌、肝、脾、肾和脑组织都有不同程度的病理改变.结论AIV对小鼠具有致病性,AIV能跨越种系障碍直接感染哺乳动物,但在小鼠间无传染性.
关键词： H5N1亚型禽流感病毒 动物 致病性 小鼠 -
禽流感病毒感染BALB/c小鼠的动态病理观察
目的 将H5N1亚型禽流感病毒(AIV)鼻腔接种BALB/c小鼠,动态观察小鼠每个时期主要器官组织的病理变化.方法 将100μl H5N1亚型禽流感病毒原液滴入经麻醉后BALB/c小鼠鼻腔,观察14 d,每天取材1次,固定、包埋、切片后HE染色观察各组织病理变化.结果 H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,产生一系列与禽流感病毒感染有关的动态病理改变:第1～2天(前驱期),肺轻微出血、水肿、炎性细胞浸润；第3～7天(发作期),肺损伤逐渐严重,大量出血、炎性细胞浸润、严重水肿、淤血、肺泡实变塌陷或者气肿；第8～14天(恢复期),各种损伤逐渐减轻,出血渗出减少,水肿减轻,肺间质出现纤维化而趋于恢复正常.肝、肾、脑出现病理改变.结论 通过动态观察病理,弄清了禽流感病毒每个时期在BALB/c小鼠体内造成的病理损伤.
关键词： H5N1亚型禽流感病毒 Balb/c小鼠 动态病理观察
