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2005～2006年湖南省人感染高致病性禽流感(H5N1)实验室诊断及病毒基因特性研究
为了对2005～2006年湖南省2例不明原因肺炎病例进行实验室诊断,确定病因以及对其进行病原学研究,采集病例呼吸道标本和血清标本,对呼吸道标本采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测H5亚型禽流感病毒核酸,对血清标本采用血凝抑制试验检测特异性抗体,并对其中1例死亡病例(病例2)的肺穿刺物标本进行病毒分离,所获毒株予以测序及同源性分析.结果显示,2例病例H5亚型禽流感病毒核酸检测均为阳性,病例1恢复期血清H5N1特异性抗体阳性,并且较急性期血清呈4倍以上增长;病例2急性期血清特异性抗体阴性,2例均为人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)确诊病例.从病例2分离得到毒株A/Hunan/1/2006,测序及分子特性分析表明,其8个基因片段均为禽源,且与湖南本地禽类分离的病毒相似,并未与人流感病毒发生基因重组或产生显著变异.
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高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和抗体及表位的鉴定
目的 制备并鉴定中国境内流行的高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白(HA)的中和抗体及其表位.方法 选取9个HA候选抗原表位序列设计串联表位,利用表面线性表位抗体库(SEAL)专利技术制备单克隆抗体.亲和层析纯化抗体,酶联免疫吸附实验检测亚型及与合成肽结合的剂量依赖性,假病毒微量中和实验筛选中和抗体,免疫印迹法验证与不同毒株HA的结合.结果 共制备了23株单抗,其中亚型鉴定10株为IgG型;证明3株IgG3亚型的抗体具有高中和活性,均能与4种不同分枝HA结合;中和抗体识别肽为“LIKKNNAYPT”和“R/KSSFFRNV-VW”且具有剂量依赖性.结论 鉴定出3株分泌抗中国境内流行H5N1 HA的中和抗体,其对应的HA抗原表位为中和表位,可作为H5N1疫苗研制的候选表位.
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H5N1禽流感假病毒体外中和试验技术平台的建立与应用
目的 建立H5N1禽流感假病毒的体外中和试验技术平台,并系统评价2份H5N1人禽流感患者恢复期血清的中和效价.方法 通过磷酸钙沉淀法将转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV△8.2和包膜载体CMV/R-SZ(或CMV/R-TH)共转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清液,免疫印迹(Western blot)鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,并取200μL假病毒上清液测定感染活性.收集制备假病毒过程中整合HA蛋白的293T细胞,通过流式细胞术测定2份恢复期血清中的HA抗体.利用2份恢复期血清分别与深圳株和泰国株假病毒进行中和试验,通过计算IC5o判断不同血清对2株假病毒中和效价的差异.结果 构建的2株假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2.200μL假病毒上清液感染靶细胞后RLA值约为2×104,具有较高的感染效价.FACS检测结果显示2份血清中均含有HA抗体,而且对不同分枝的假病毒具有交叉反应性.中和试验表明2份血清对深圳株和泰国株假病毒均具有中和能力,而且对不同分枝的假病毒具有交叉中和活性,但对深圳株的中和效价均高于泰国株.结论 本研究成功构建具有感染活性的深圳株和泰国株H5N1禽流感假病毒,并可以快速、安全、高效的评价血清的中和效价,具有广阔的应用前景.
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人用H5N1禽流感裂解疫苗的制备工艺
目的 设计3种工艺,制备不同裂解程度的禽流感疫苗,并观察其免疫效果.方法 用禽流感毒种R1203株制备3种禽流感疫苗(全病毒、裂解-1和裂解-2),并分别以不同剂量免疫大鼠和家兔,肌肉接种2针(间隔14 d),初免后14 d和28 d静脉采血,检测动物血清中血凝抑制抗体和中和抗体.结果 两种动物在疫苗接种1针后14 d,血抑抗体和中和抗体滴度均较低;接种2针后14 d,均显著高于1针;裂解-2疫苗接种两种动物后的抗体反应均高于其他两种疫苗,且家兔的中和抗体量.效反应明显.结论 裂解.2疫苗的工艺优于其他两种疫苗,其中和抗体能正确反映疫苗的质量.
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南昌市家禽养殖环境及人群H5N1禽流感监测分析
目的 了解南昌市家庭内禽类养殖人员及养殖环境H5N1禽流感病毒感染状况.方法 应用one-step RT PCR监测环境标本中H5N1禽流感病毒,应用单扩溶血试验和马血球血凝抑制试验监测人血清样品中H5N1禽流感病毒抗体.应用描述性分析方法对数据进行分析.结果 2009-2013年共采集640份环境标本,阳性率1.4％.仅2009年在禽类污染的污水中检出9份H5N1禽流感病毒阳性样本,其他年份环境标本中无阳性样本检出;共检出血清H5N1禽流感抗体阳性标本共5份,占监测人群的1％,家禽散养户2例,家禽规模养殖场2例,家禽屠宰加工厂1例,分别占相关人群的0.80％、0.69％和1.72％.其中2009年4份,2011年1份.结论 禽类职业暴露人群中存在H5N1禽流感病毒的隐性感染者,提示禽类职业人群在工作中应加强个人防护工作,同时应限制家庭内禽类散养.
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国内H5N1禽流感文献计量分析
以中国学术期刊网络出版总库和万方医学网为统计源,对国内H5N1禽流感期刊文献从年度发文量、期刊分布、核心作者、单位分布、地区分布几方面进行统计分析,以了解我国H5N1禽流感文献分布特点和研究现状,为相关学者进行研究提供参考信息。
