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汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用
目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒(HV)S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG.方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白(NP)编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统rBAC-Z10S-TN.间接荧光法了解重组NP(rNP)表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况.建立免疫印迹法检测肾综合征出血热(HFRS)患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较.结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应.经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67％.结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统.所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法.
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SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究
目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.
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汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用
目的 克隆并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)N蛋白(NP)编码基因,建立基于辣根过氧化酶(HRP)标记重组NP(rNP)的rNP-IgM直接捕捉ELISA,检测肾综合征出血热(HFRS)患者血清并评价其检测效果.方法 PCR扩增HV-Z10株NP编码基因,基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a-Z10N-E.coli BL21DE3.SDS-PAGE了解rNP表达情况,离子交换法和Ni-NTA亲和层析法提纯rNP.Western blot检测rNP的特异性免疫反应性.建立HRP标记rNP-IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品,并与常规HV-IgM间接捕捉ELISA进行比较.结果 pET28a-Z10N-E.coli BL21DE3高效表达rNP.提纯rNP SDS-PAGE显示单一蛋白条带,HV-IgG能有效识别rNP并与之结合.94.73%(90/95)HFRS患者血清样品rNP-IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性,HV-IgM间接捕捉ELISA阳性率为92.63%(88/95).两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450均值变化均相似.结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效原核表达系统.所建立的rNP-IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法.
关键词： 汉坦病毒 N蛋白 重组表达 IgM捕捉ELISA -
SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定
为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究.构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清.用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应.与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性.免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应.Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30～60aa、170～184aa、301～320aa和360～422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30～60aa、90～120aa、204～214aa和320～360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30～60aa、150～160aa和301～360aa.含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60～214aa)和N185(30～214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应.上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据.
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北京地区人冠状病毒NL63 N和E蛋白基因序列及生物信息学分析
为了解北京地区新近发现的新型冠状病毒-人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)的N和E蛋白编码基因的特征,从经RT-PCR检测阳性的临床标本中扩增得到的HCoV-NL63 N蛋白和E蛋白编码基因序列,分别克隆至pCF-T和pUCm-T载体中并进行测序,同时运用生物信息学的方法,对北京HCoV-NL63阳性标本BJ8081 N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列与HCoV-NL63原型株及其他几种冠状病毒的N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列进行比较分析和种系进化分析;用SOPMA方法对BJ8081 N和E蛋白的二级结构进行了预测分析,并对N和E蛋白的其他生物学特性进行了预测分析.经序列比对分析发现,BJ8081 N蛋白氨基酸序列在78～85肽段(FYYLGTGP)内与所比较的其他冠状病毒N蛋白相应位置的氨基酸序列完全相同,提示此区段可能为包括HCoV-NL63在内的所有冠状病毒N蛋白的保守区域.在BJ8081 N蛋白氨基酸序列的100～121肽段可能是和基因组RNA相结合的位置;在BJ8081 E蛋白的15～37位氨基酸可能是E蛋白的跨膜区域.研究对BJ8081 N蛋白和E蛋白的编码基因序列进行了测定和生物信息学分析,为今后对HCoV-NL63的进一步深入研究奠定了基础.
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一株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体抗原表位的鉴定
PEDV N蛋白为高度保守性蛋白,具有极强的免疫原性,因此在临床诊断中具有重要作用.本文对实验室前期制备的针对N蛋白的单克隆抗体9 G11的抗原表位进行精确定位.通过与N蛋白进行免疫印迹反应证明9G11所识别的表位是N蛋白的线性表位.利用NEB十二随机肽库进一步定位9G11核心表位氨基酸,结果显示位于N蛋白75～78位的氨基酸FYYL为9G11所识别的关键氨基酸.对20株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明此表位高度保守.确定该抗体识别的抗原表位有助于了解N蛋白的结构与功能,同时也为以表位为基础的快速、准确并具临床应用价值的PEDV诊断方法的建立打下良好基础.
关键词： 猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白 单克隆抗体 抗原表位 -
检测人血清中SARS冠状病毒IgG抗体的ELISA方法建立及其应用
为了建立方便、敏感和特异的SARS病毒血清学诊断方法,利用PQE30表达系统在大肠杆菌M15中分段高效表达了SARS病毒N蛋白.通过金属鏊合亲和层析纯化了目的蛋白N-1和N-2,Western blot结果显示,两个表达蛋白均具有较好的抗原性.然后将N-1和N-2蛋白共同包被,建立了检测人血清中SARS病毒IgG抗体的间接ELISA法.用此方法检测120例临床诊断为SARS的病人和244个不同年龄组正常人血清IgG抗体,结果120例SARS病人的第一份血清IgG抗体总阳性率为60.0%,发病第0～7、8～10、11～14、15～27和28天后的血清中,SARS病毒IgG抗体阳性率分别为0、11.1%、60.0%、60.5%和70.3%;而244份正常人血清检测结果均为阴性,包括100份14岁以下儿童血清也未发现假阳性.结果表明,利用大肠杆菌表达的N蛋白完全能够替代全病毒灭活抗原,所建立的间接ELISA方法简单,价格低廉,能保证生物安全,对SARS可疑病例的确诊和排除具有重要的实际应用价值,可用于SARS高危人群的血清流行病学监测,SARS疫情的控制和预防,以及SARS病毒蛋白功能的研究.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) 冠状病毒 N蛋白 ELISA -
抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体(scFv)筛选
目的 筛选出抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体.方法 利用原核表达所获得的SARS病毒N蛋白,筛选人源单链抗体噬菌体展示库,经特异性的检测,以期得到抗SARS-CoV病毒N蛋白的特异单链抗体.结果 获得了8个抗SARS病毒N蛋白的候选克隆.经测序,获得了编码抗体可变区的基因序列,并进行了原核表达.结论 筛选得到的抗SARS-CoV病毒N蛋白单链抗体具有高度的特异性,可以用作临床实验或研究SARS病毒过程中快速检测SARS N蛋白或SARS病毒粒子的候选抗体.
关键词： SARS-CoV病毒 N蛋白 人源单链抗体噬菌体展示 -
SARS冠状病毒基础研究进展
SARS(severe acute respiratory syndrome,严重急性呼吸综合症)是严重危害人类健康的传染病,现已发现其病原体为正链RNA冠状病毒(coronavirus,CoV),SARS CoV为一类新型的冠状病毒,至今没有有效对抗其感染的药物.本文从SARS CoV的功能受体、蛋白酶、疫苗和RNA干扰技术在SARS CoV研究中的应用等方面综述了其基础研究进展,旨在为抗SARS CoV的药物研制提供一定的理论依据.
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自制汉坦病毒N蛋白IgM直接捕捉ELISA诊断试剂盒的初步评价
目的 初步评价应用自制辣根过氧化物酶(HRP)标记汉坦病毒(HV)重组N蛋白(rNP)的rNP-IgM直接捕捉ELISA诊断试剂盒.方法 考核该试剂盒的特异性和稳定性;比较其与同类商品试剂盒的临床检测结果,以评估检测血清抗HV-IgM的敏感性.结果 (1)该试剂盒仅与抗HV-IgM阳性血清发生反应,而与抗水痘病毒-IgM(抗VZV-IgM)、抗流行性乙型脑炎病毒-IgM(抗JEV-IgM)、抗登革热病毒-IgM(抗DV-IgM)、抗手足口EV71病毒-IgM(抗EV71-IgM)阳性血清均无反应;试剂盒放置37℃ 3 d,检测血清抗HV-IgM的活性,无明显降低.(2)在120例临床疑似.肾综合征出血热的144份血清中,2种试剂盒仅对12例的12份血清抗HV-IgM检测结果不一致,其中8例的首份血清,该试剂盒阳性,商品试剂盒阴性(第2份血清2种试剂盒均阳性);3例的首份血清(未采到第26血清),该试剂盒为临界值,商品试剂盒阴性;另1例的首份血清该试剂盒阳性,商品试剂盒阴性(2种试剂盒第2份血清和第3份血清均阳性).结论 实验室研制的捕获法ELISA抗HV-IgM诊断试剂盒具有良好的特异性、稳定性和敏感性,适于HV感染的临床诊断和流行病学监测.
关键词： 汉坦病毒 N蛋白 重组表达 IgM捕捉ELISA -
SARS冠状病毒N蛋白的克隆与表达
目的克隆和表达SARS冠状病毒N蛋白,并分析其免疫学活性.方法采用RT-PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌JM109,PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达N蛋白,亲和层析予以纯化;免疫印迹分析纯化蛋白对SARS的诊断效果;用纯化的融合蛋白免疫小鼠观察其诱导的抗体应答.结果RT-PCR扩增出N蛋白基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的SARS冠状病毒的N蛋白基因序列同源性为99.8%;N蛋白基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-2,在JM109中表达了N蛋白,表达的蛋白经亲和层析获得纯化;纯化蛋白能被SARS病人血清识别;免疫小鼠诱导产生了高滴度的抗体.结论成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的N蛋白融合蛋白具有良好的免疫学活性.
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呼吸道合胞病毒核蛋白检测抗体的筛选与鉴定
目的 筛选识别呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)核蛋白(N)的单克隆抗体,并对其性质进行鉴定.方法 使用大肠杆菌表达系统原核表达重组N蛋白,蛋白质纯化后免疫BALB/c小鼠.通过脾脏免疫、融合获得杂交瘤细胞,结合有限稀释法亚克隆细胞株,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对单克隆抗体株进行筛选,并通过蛋白质免疫印迹法(Western blot)、ELISA和间接免疫荧光技术对终筛选的单克隆抗体进行性质鉴定,根据正交试验的结果挑选捕获能力和检测效果较好的抗体进行诊断试剂的初步调试.结果 成功构建N-pTO-T7原核表达载体,并成功表达、纯化得到高纯度重组N蛋白用于小鼠免疫,终筛选获得24株N蛋白的单克隆抗体,24株抗体均具有较好的ELISA反应性,5A2等8株抗体有较好的Western blot检测特性,11H8等13株抗体可用于间接免疫荧光检测,并获得能够实现在病毒上检测N蛋白的优选配对12F2/11H8-HRP和12F2/15A8-HRP.结论 本研究成功筛选出可用于N蛋白特异性检测的单克隆抗体及抗体配对,为RSV感染机制的研究及诊断试剂的研发提供实验资料.
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SARS病毒N蛋白特异性单链抗体的筛选
目的利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体. 方法利用RT-PCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因,克隆入原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95%以上的N蛋白,然后以此蛋白包被25 cm2组织培养瓶,对SARS单链抗体库进行先松弛,后严谨的筛选、富集,进行4轮筛选后对所筛的抗体进行ELISA鉴定. 结果经过4轮的筛选、富集,得到了1株高亲和力的N蛋白单链抗体N18. 结论在对SARS疾病的早期检测或筛查、SARS病毒的生活周期及发病机理的研究中N18将起到重要的作用.
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PGEFP-C1/N载体的构建及其在转染细胞中的初步定位
目的观察SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白的亚细胞定位.方法将SARS-CoV N基因片段克隆入融合绿色荧光蛋白载体(PGEFP-C1)中.采用瞬时转染技术,在A549、VeroE6细胞株中利用荧光显微镜观察GPT-N蛋白的亚细胞定位,Western blot鉴定N蛋白的表达.结果成功构建了PGEFP-C1/N表达载体,在A549、VeroE6细胞中观察到N蛋白定位于细胞胞浆中,Western blot证实了N蛋白表达.结论 SARS-CoV N蛋白在真核细胞中定位于细胞胞质中.
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抗SARS冠状病毒N蛋白多克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白的多克隆抗体.方法 以纯化的GST-N免疫新西兰白兔,制备抗SARS-CoV N蛋白多抗,间接ELISA法检测兔血清效价,Western blot和免疫组化鉴定多抗的特异性.结果 制备的抗SARS-CoV N蛋白多克隆抗体经ELISA检测效价为1.2×10-5,Western blot和免疫组化证实此抗体可与SARS-CoV N蛋白特异性结合.结论成功地制备了抗SARS-CoV N蛋白多抗,为进一步的临床诊断和实验研究创造了条件.
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SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定
目的克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白的DNA,构建原核表达质粒pGEX-2T/N,并诱导表达.方法采用RT-PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段.将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌中表达融合蛋白.用表达产物与抗SARS-CoV抗体阳性血清做Western blot.结果获得N基因片段;GST-N融合蛋白以可溶形式表达;Western blot检测表明,其与抗SARS-CoV抗体阳性血清的反应呈阳性.结论成功地构建原核表达质粒pGEX-2T/N,并表达GST-N融合蛋白,为下一步的研究奠定了基础.
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基于N蛋白稳定表达细胞株的SARS-CoV间接免疫荧光检测方法的建立
目的:建立基于SARS-CoV N蛋白稳定表达细胞系的间接免疫荧光法,以在普通实验室对SARS-CoV特异抗体进行检测.方法:将含有SARS-CoV N基因的重组质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,筛选稳定表达细胞系并制备间接免疫荧光抗原片,以鼠抗SARS血清进行检测,并以其他呼吸道病毒抗体评估其特异性.结果与结论:建立了可检测SARS-CoV抗体的基于SARS-CoV N蛋白稳定表达重组细胞系的间接免疫荧光法,检测其他呼吸道病毒抗体为阴性,特异性良好.该间接免疫荧光法为SARS-CoV抗体的普通实验室检测提供了快速安全的诊断方法.
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SARS-CoV抗原化学发光免疫分析法的应用
目的建立一种可用于严重急性呼吸综合征(SARS)早期诊断的简便、快速、灵敏的实验室检测方法.方法采用化学发光免疫分析方法(chemiluminescence immunosaasy,CLIA)测定12种不同病毒培养上清和人血中SARS冠状病毒核衣壳蛋白 (nucleocapsid protein)抗原(SARS-CoV-N).结果 7种不同SARS毒株测定均为阳性,12种非SARS毒株测定均为阴性,低可检出核酸定量为6.3×101 PFU/mL的SARS-CoV培养上清;测定63例临床确诊SARS的阳性血清样本,发病6～10 d的样本检出率高,可达100%;测定1 066例正常人样本,99.35%为阴性.结论 SARS-CoV的CLIA的灵敏度和特异性较高,并且简便、快速,在SARS的早期诊断中展示了良好的应用前景.
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犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因的合成和杆状病毒表达载体的构建
目的 串联合成犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因,并构建其杆状病毒表达载体.方法 利用生物信息学软件,预测N蛋白的抗原表位,串联合成这些抗原表位.利用定向克隆的方法,将该基因片段连接到杆状病毒表达载体pFastBac-Hta.结果 获得了包含犬瘟热病毒N蛋白抗原表位的基因,并成功构建pFastBac-N合成表达载体.结论 该实验为犬瘟热病毒N蛋白抗原表位基因在杆状病毒内的表达奠定了基础.
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SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化
目的原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白.方法用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E.coli BL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白.结果实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化.结论用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件.
