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荧光微球分析技术及其应用
荧光微球分析技术是近年来化学材料科学活跃发展的产物,各种大小(0.02～10 μm)可产生荧光和色彩的人工微球应运而生,目前各种材料人工合成、多种颜色和规格的荧光微球有2大类,一种是表面不带修饰基团的微球,另一种是携带各种化学修饰基团,包括羧基化修饰、氨基修饰、巯基或醛巯基修饰等的微球.
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联合检测炎症因子IL-6、TNF-α和MCP-1对冠心病临床诊断价值
冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞,或(和)因冠状动脉功能性改变(痉挛)导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病."炎症假说"是动脉粥样硬化主要发病机制[1],白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)等炎症性因子在其过程中发挥着重要的作用.目前流式细胞仪在临床上的应用不断扩大,鉴于此本研究应用荧光微球编码技术,建立了流式微球分析技术(cytometric bead assay,CBA)联合检测IL-6、TNF-α和MCP-1的方法,对冠心病患者血清进行检测,发现其对冠心病的诊断具有一定的临床应用价值,现报道如下.
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流式微球分析技术检测人心肌钙蛋白T方法的建立
目的 建立流式微球分析技术(cytoometric bead assay,CBA)检测人肌钙蛋白T(cTnT)方法.方法 用鼠抗人的cTnT的单克隆抗体包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上,然后再用包被好的微球与检测标本进行抗原抗体免疫反应,并加入羊抗人cTnT的多克隆抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的驴抗羊的IgG,室温避光免疫反应一定时间后洗涤一次,上流式细胞仪检测FITC的荧光强度,以此测定标本中cTnT含量.结果 通过正交试验,在100 μl反应体系中,微球含量大约为1.25×106,选择10 μg的鼠抗人cTnT单克隆抗体为佳加入量,加入标本和抗体后,选择避光反应时间为120 min,洗涤选择一次,选择8 μg/ml羊抗人cTnT多克隆抗体和20 μg/ml FITC标记驴抗羊IgG为佳工作浓度;方法检测灵敏度为16.0 pg/mL,线性范围是16-5 000 pg/mL,批内重复性变异系数为5.2-11.3%,回收率是94.7-111.5%,高浓度的胆红素、胆固醇和甘油三脂无明显干扰,与Roche Elecsys的电化学发光法有较好的相关性.结论 自建CBA检测cTnT技术性能较好,可在临床工作中推广使用.
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流式微球分析技术应用于小鼠血清免疫球蛋白同种型的检测研究
目的:建立流式微球分析技术鉴定免疫球蛋白同种型的方法,为其应用于单克隆抗体制备提供参考.方法:采用绵羊红细胞致敏小鼠产生相应抗体,利用Mouse ImmunoglobulinIsotyping CBA Kit检测血清中免疫球蛋白同种型及κ、λ轻链的表达.结果:阴性对照显示所有免疫球蛋白同种型检测阴性;标准样品1显示IgG1λ,IgG2bλ,IgAλ和IgG1κ,gG2b κ,IgAκ,IgEκ阳性,标准样品2显示IgG2aλ,IgG3λ,IgMλ和IgG2aκ,IgG3 κ,IgM κ阳性;与标准一致.原血清检测显示所有免疫球蛋白同种型均阴性;血清1:10～1:100000稀释后检测结果显示IgMλ链及IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgA,IgM κ链随稀释倍数不同有不同的表达.血清在1:1000～1:10000稀释范围检测结果较一致,其中又以1:5000为佳检测浓度.而血清1:100稀释后虽然κ链的表达均能检测到,但与表达的水平不相关;血清1:100000稀释后只检测到IgG1,IgG2bκ链的表达.结论:CBA方法分析免疫球蛋白同种型属于定性检测,方法灵敏、简便快速且便于大量检测,是目前鉴定免疫球蛋白同种型的较优方法.
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流式微球分析技术联合检测Cys C、NGAL方法的建立及其在肾移植术后CMV感染患者中的应用
目的 建立流式微球分析技术联合检测胱抑素(Cys)C和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的方法,并初步研究两者在肾移植术后巨细胞病毒(CMV)感染患者血清中的含量变化.方法 实验方法的建立包括检测微球包被的效果和稳定性,优化Cys C和NGAL的检测含量范围,确定生物素化抗体浓度,确定PE-链霉亲和素浓度,绘制标准曲线图确定相关系数.采用该法检测对照组(10名健康人)、CMV阴性组(10例肾移植术后CMV-pp65阴性患者)和CMV阳性组(20例肾移植术后CMV-pp65阳性患者)的血清Cys C和NGAL含量.结果 成功建立流式微球分析技术联合检测Cys C和NGAL的方法.对照组、CMV阴性组和CMV阳性组的血清NGAL含量分别为8759 (1465) pg/ml、10472 (856) pg/ml、12 817(4 533) pg/ml,依次升高且差异有统计学意义(P＜0.001).3组间Cys C比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本实验建立流式微球分析技术联合检测Cys C和NGAL标准曲线的方法相关性和重复性良好,并初步验证NGAL含量在肾移植术后CMV感染中明显升高,提示肾移植术后CMV活动性感染可能对肾小管造成急性损伤.
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流式微球检测超敏C反应蛋白方法学的建立及性能评价
目的 建立流式微球分析技术(CBA)检测人血清中超敏C反应蛋白(hs-CRP)的方法并对其进行系统性评价.方法 将hs-CRP鼠抗人单克隆抗体包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上,用正交试验对试验条件进行优化选择,并应用美国临床实验室标准化协会的有关规则进行方法学评价.结果 试验选择hs-CRP鼠抗人单克隆抗体的加入量为10 μg,生物素标记的羊抗人单克隆抗体的稀释倍数为1∶540,第一次反应时间为2 h、洗涤2次,PE标记亲和素的稀释倍数为1∶1 000,第2次反应1 h洗涤1次.方法学评价显示,CBA检测hs-CRP的分析灵敏度为0.03 ng/mL,线性范围为0.03～333.33 ng/mL,批内变异系数为2.70%～4.44%,批间变异系数为4.99%～9.52%,准确度相对偏倚为2.17%～4.39%,回收率为98.31%～104.60%.高浓度的三酰甘油、胆固醇和胆红素对3种因子有一定的干扰率,低浓度的三酰甘油、胆固醇和胆红素对3种因子干扰较小.分别与免疫荧光方法比较差异无统计学意义.结论 自建的hs-CRP流式微球检测技术性能指标满足公认的质量指标,可拓展流式细胞分析技术,值得临床推广使用.
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流式微球分析技术联合检测血清MMP-9、MPO CD40L和t-PA的方法学建立及评价
目的 建立流式微球分析技术联合检测人血清中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、髓过氧化物酶(MPO)、CD40配体(CD40L)、血浆纤溶酶原激活物(t-PA)的方法并对其进行系统性评价.方法 分别将四种选择好一定浓度的捕获抗体(MMP-9、MPO、CD40L和t-PA鼠抗人单克隆抗体)包被在四种已激活的不同荧光强度编码的羧基化聚苯乙烯微球上,用棋盘法对试验条件进行优化选择,并应用CLSI的有关规则进行方法学评价.结果 反应体系中四种鼠抗人单克隆抗体佳加入量为10 μg,佳生物素标记抗体浓度为1∶4000倍稀释,佳反应时间为2h,亲和素适孵育时间为1h.MMP-9线性范围是0.20～333.33 ng/mL,批内变异系数为4.60％～8.80％,批间变异系数为8.80％～9.60％,准确度相对偏倚为2.80％～3.18％,回收率是94.8～102.50％,灵敏度为0.20 ng/mL;MPO线性范围是0.26～111.11ng/mL,批内变异系数为5.90％～7.70％,批间变异系数为9.10％～11.40％,准确度相对偏倚为1.44％～4.12％,回收率是97.8～103.2％,灵敏度为0.26 ng/mL;CD40L线性范围是0.32～111.11g/mL,批内变异系数为5.40％～6.50％,批间变异系数为8.90％～12.40％,准确度相对偏倚为2.72％～5.95％,回收率是97.20～105.30％,灵敏度为0.32 ng/mL;t-PA线性范围是1.21～111.11 ng/mL,批内变异系数为2.20％～2.90％,批间变异系数为6.30％～12.20％,准确度相对偏倚为1.23％～4.60％,回收率是97.20～101.30％,灵敏度为1.21 ng/mL.高浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对四种因子有一定的干扰率,低浓度的甘油三酯、胆固醇和胆红素对三种因子干扰较小.分别与ELISA方法比较无显著差异.结论 自建的MMP-9、MPO、CD40L和t-PA1流式微球联合检测技术,可拓展流式细胞分析技术,值得临床推广使用.
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流式微球分析技术检测Hs-CRP对冠心病的临床诊断价值评价
目的 探讨流式微球分析技术检测人血清中高敏C反应蛋白(Hs-CRP)水平对冠心病诊断的临床价值.方法 采用流式微球分析技术检测健康人群和冠心病患者血清中Hs-CRP水平,用统计软件对其临床诊断效能进行评价.结果 健康对照人群和患者血清标本中Hs-CRP水平差异有显著性.疾病组内不同病理类型(稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死)之间Hs-CRP的检测结果差异均有显著性.根据Hs-CRP的ROC曲线下面积(AUC)进行统计分析,血清Hs-CRP水平用于诊断冠心病有显著意义,诊断灵敏度为87.5％,特异性为82.5％.结论 血清中Hs-CRP水平对冠心痛的诊断和分层有一定的应用价值,值得在临床上推广.
关键词： 流式微球分析技术 冠心痛 高敏C-反应蛋白(hs-CRP)
