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安徽省29所幼儿园儿童隐孢子虫感染流行病学调查
为了解安徽省幼儿园儿童隐孢子虫感染情况及流行特点,进行了此项调查,结果简报如下.1.对象与方法:按随机化原则,以班为单位进行整群抽样,于2001年 5~10月在安徽省内11个地、市29所幼儿园共对1204名儿童(年龄 3~6岁,平均年龄 4.39岁,其中男性儿童641人,女性儿童563人;城市儿童684人,乡镇儿童520人)粪便标本进行检测.粪便标本采用金胺-酚染色法、改良抗酸染色法、沙黄-美蓝染色法、金胺-酚改良抗酸复染法4种方法染色,显微镜下检查隐孢子虫卵囊.
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微小隐孢子虫卵囊的形态结构与染色观察
目的 研究隐孢子虫卵囊的形态与染色特点.方法 应用图像分析系统,观察隐孢子虫卵囊的形态与内部结构,并应用Adobe Photoshop CS4软件绘制各种卵囊形态的模拟图.卵囊经改良抗酸染色法、姬姆萨染色法、阿利新蓝染色法和苏木精-伊红染色法染色后观察其染色特点.结果 隐孢子虫卵囊呈圆形或椭圆形,外层有一薄的卵囊壁,内部含有0~4个月牙形子孢子和圆点状残留体,个别卵囊呈空泡状.隐孢子虫卵囊经改良抗酸染色、姬姆萨染色、阿利新蓝染色和HE染色后,分别呈现玫瑰红色、蓝色、绿色和红色.结论 隐孢子虫卵囊形态和内部结构多样,改良抗酸染色法染色效果较好.
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隐孢子虫卵囊3种分离纯化方法的比较
隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.p.)是一种引起人类和动物腹泻的重要病原体,日益受到国内外学者的重视.我国于1987年在南京首次发现该病例,此后许多地区陆续有病例报道.隐孢子虫引起的腹泻是艾滋病病人致死的主要原因.隐孢子虫主要寄生于宿主的胃肠道,卵囊随粪便排出体外,易感者经粪口途径感染隐孢子虫后发病.检查粪便中的隐孢子虫卵囊是诊断隐孢子虫病的主要依据,从粪便标本中分离纯化卵囊,是对隐孢子虫进行深入研究的前提.本研究选择3种原虫分离纯化方法,用于隐孢子虫卵囊的分离纯化,并进行了初步比较.
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用PCR检测隐孢子虫
隐孢子虫(Cryptosporidium)是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的一种能广泛感染脊椎动物的寄生原虫。该虫已被公认为人和动物腹泻的重要病原体,是引起三大肠道病病原体之一,已受到国内外学者的重视。在发达国家与发展中国家腹泻病人中,隐孢子虫感染率分别为0.6%~7.3%与3%~13%。国内1986年陈义民等在兰州犊牛中首次发现隐孢子虫,次年韩范等在南京首次发现人体病例[1]。此后许多地区均报道有隐孢子虫感染。该病多发于免疫抑制的患者,而免疫功能正常虽无临床症状者但也能够排出卵囊,污染环境。更要注意的是隐孢子虫卵囊在自来水中存活率很高,在1993年正是隐孢子虫污染了饮用水,造成美国的Milnoukee暴发400 000人的大流行[2]。1995年报道小剂量(50%感染剂量ID50为132个卵囊)的卵囊足以引起血清呈阴性的健康自愿受试者感染[3]。由于隐孢子虫形体小,对恶劣环境有较强的抵抗力,无特异性染色,光镜下缺乏明显特征,少量卵囊足以使人感染,因而建立一种敏感性高、特异性强的的检测方法是当前隐孢子虫病防治和流行病学调查研究工作迫切需要解决的问题之一。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)技术,有快速、简便、准确、高度敏感与高度特异等优点。Laxer等[4]和Webster等[5]先后将该技术成功地应用于隐孢子虫检测,为建立敏感性高、特异性强的隐孢子虫检测方法开辟新途径。本文就当前在检测隐孢子虫中所使用的PCR方法综述如下。
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隐孢子虫病的病原学诊断及病例对照研究
目的 为了验证接触动物、营养不良与隐孢子虫病感染有显著的统计学联系,探讨隐孢子虫病的病原学诊断方法 .方法 根据随机化的原则,在湖南省湘南地区用改良抗酸染色法检测隐孢子虫卵囊,以卵囊阳性为病例,卵囊阴性者为对照.将同一粪便标本一式二份,分别用碘染色法和改良抗酸染色法进行对比测试.结果 接触动物者感染隐孢子虫的aOR=3.74.aOR=3.14.营养不良者感染隐孢子虫的a0R:4 66.aOR=4 35.碘染色法检出卵囊41例,阳性率1.9%,改良抗染色法检出卵囊41例,阳性率1.9%,符合率为100%.结论 动物是人感染隐孢子虫的重要传染源,接触动物是隐孢子虫感染的重要的危险因素.营养不良所致的继发性细胞免疫功能缺陷及胃肠道形态学的功能变化,是造成易感染隐孢子虫病的危险因素.碘染色法简便,可靠,是检测粪便中CSO较理想的方法 .
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混凝沉淀法富集分离水中隐孢子虫卵囊的实验研究
目的 建立混凝沉淀富集回收水中隐孢子虫卵囊的方法.方法 以4 μm荧光微球为研究对象,采用混凝沉淀试验,通过正交设计筛选出佳混凝剂[聚合氯化铝(PAC)、水溶性壳聚糖(WSC)、1 mol/L的NaOH溶液用量]的配方,并观察不同pH值(6~9)、浑浊度(0~15 NTU)和水温(5~15℃)对回收率的影响.结果 确定了佳混凝配方,聚合氯化铝浓度为80 mg/L,壳聚糖浓度为30 mg/L,1 mol/L氢氧化钠溶液用量为0.6 ml.当pH值在6~9范围内,回收率均在86%以上;当水温在5~25 c℃范围内,回收率在55%以上;当浑浊度为0~15 NTU范围内,回收率均在90%以上.且回收率均随着pH值、水温和浑浊度的升高而上升.向实际水样投加隐孢子虫,采用混凝沉淀法与EPA1623法进行富集比较,差异无统计学意义.结论 该方法能够高效富集回收水中的隐孢子虫卵囊,并对实验条件要求较低,适用于一般实验室对水中隐孢子虫卵囊的检测.
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中试装置去除饮水中贾第虫与隐孢子虫的简介
为了从饮水中有效地去除贾第虫孢囊和卵囊,需要采取多种处理方法,通常包括进行有效的水源防护,优化处理及配备完好的配水系统.本研究主要针对3种处理装置开展了研究,分析了原水和净化后的水样,测定贾第虫孢囊与隐孢子虫卵囊的浓度和去除率,以及孢囊与卵囊浓度和水的浑浊度及微粒物的粒度之间的关系.
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隐孢子虫卵囊基因组的提取及以保守基因为靶标的PCR检测
目的 探讨提高PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法 的特异性和敏感性,为防止隐孢子虫病流行提供检测依据.方法 应用BALB/c小鼠感染扩增卵囊,不连续蔗糖密度梯度离心法从粪便中纯化卵囊,通过冻融和超声法破碎卵囊,然后以酚/氯仿/异戊醇法提取基因组DNA作为PCR扩增模板,根据隐孢子虫保守基因18S rRNA,设计一对特异性的引物,扩增约450 bp的目的 片段.结果 超声处理法对隐孢子虫卵囊的破囊率为92%,明显高于冻融法的86%.2个组抽提的DNA作为模板均扩增出目的 片段,但超声处理组敏感性高于冻融处理组,分别能检测到卵囊2个/mL和20个/mL.结论 超声法对微小隐孢子虫卵囊的破碎效果优于冻融法,经改进的PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法 具有特异性好和敏感性强的特点.
关键词: 隐孢子虫卵囊 基因组提取 18S rRNA基因 PCR -
隐孢子虫卵囊纯化方法的改进研究
用蒸馏水代替PBS稀释Sheather's蔗糖溶液,并测定不同稀释度的蔗糖溶液密度,使用不同密度的蔗糖溶液分离纯化安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫和猪隐孢子虫卵囊,计算纯化后的卵囊回收率和卵囊活性.安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫和猪隐孢子虫卵囊纯化后的总回收率分别为47.5%、49.6%和41.7%:孔雀绿染色活性检测的活性率分别为97.9%、96.7%和95.1%;37℃水浴1 h后的脱囊率分别为87.9%、80.0%和81.7%.
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粪检隐孢子虫卵囊阳性幼儿血清PA和Fn的检测
血清前白蛋白(prealbumin,PA)、纤维结合蛋白(Fibronectin,Fn)是血浆中的两种时相蛋白,亦是机体蛋白营养的指标[1,2].为评价隐孢子虫感染对机体营养状况的影响,本文对隐孢子虫病流行病学调查中获得的28例患儿进行了血清PA和Fn的检测,结果报告如下.
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长期保存的隐孢子虫卵囊粪便涂片染色
隐孢子虫(Cryptosporidium Tyzzer)可引起人和多种哺乳动物严重腹泻,隐孢子虫病已被列为世界常见的六种腹泻病原之一[1].免疫力正常的隐孢子虫病患者,主要表现为急性腹泻,常为自限性;免疫力低下或免疫受抑制的患者,则可出现严重的胃肠炎和水样腹泻,导致大量体液丢失而危及生命.隐孢子虫病的诊断目前普遍采用的是粪便涂片染色显微镜油镜下检查的方法[2],查到卵囊可确诊.理想的制片染色对疾病的诊断、教学中学生准确认识及掌握隐孢子虫的形态有很大的帮助,为解决目前教学科研中标本来源的困难,我们对10余年前所保存下来的隐孢子虫病人粪便进行了染色方法的改良研究,现报告如下.
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核酸分子生物学技术在隐孢子虫研究中的应用
核酸分子技术是建立在任何一种生物均具有独特的核苷酸系列的基础上对核酸分子进行研究的方法,随着现代分子生物学技术的迅速发展,对某一生物(包括寄生虫)的核酸有了深入的研究,并已经用于寄生虫的研究[1],所涉及的研究方法有分子杂交技术、DNA探针〔2〕、PCR(多聚酶链反应)〔3〕、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)〔4〕和核酸序列分析〔5〕等。人体隐孢子虫病ryptosporidiosis)1976年在美国首次报道,国内于1987年由韩范在南京第一次报道〔6〕,以后在世界各地包括中国各地陆续有隐孢子虫病病例报道,甚至在特定人群中有暴发流行〔7,8〕。在隐孢子虫研究中核酸分子技术上主要应用于样本中隐孢子虫卵囊检测、隐孢子虫病的诊断、流行病学调查及虫种鉴定和虫株分型。核酸技术用于隐孢子虫病诊断,可以用于鉴别隐孢子虫的近源种或不同株型,在流行病学调查中确定传播途径或考核治疗效果。目前这些方法大多处于研究阶段,在临床或大面积应用时还受到一定限制。
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鼠隐孢子虫感染模型的建立
隐孢子虫(Crytosporidium)是一种新近被人们重视的腹泻的重要病原之一.1970年Tyzzer在无症状的实验小鼠胃组织切片时发现了大量的隐孢子虫体.1976年由Nirm和MeiseI等在美国首先发现.1981年早从动物体内检查抗体.多数隐孢子虫病患儿的临床症状类似一般的肠炎,细菌性痢疾,消化不良,表现为间隙性难治性腹泻,重者可导致死亡.为建立隐孢子虫的动物模型,以探讨该病发病机理,观察其病理变化与排卵囊规律,提供药物治疗有价值的依据.本研究利用氢化可的松,环磷酰胺抑制白鼠免疫功能后分别接种高,低浓度隐孢子虫卵囊以建立隐孢子虫感染模型,现报告如下.
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隐孢子虫颅内感染1例
1976年,Nime和Meisel等人首次报道了人类的隐孢子虫病(CSS),目前普遍认为隐孢子虫感染是一种世界性的人兽共患病,20世纪80年代后期以来,相继创建了许多隐孢子虫卵囊(CCO)的检测技术,病原学诊断多以粪便中检出卵囊为根据,检出率4%~13%[1].国内自1987年发现人体病例以来,已有多篇隐孢子虫致腹泻的报道.但未见颅内感染报道,现将我院2001年3月收治的1例报告如下:
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犊牛隐孢子虫卵囊的分离与鉴定
采集南京地区三个奶牛场2~4周龄犊牛新鲜粪便,应用不连续蔗糖密度梯度离心法分离纯化隐孢子虫卵囊,然后通过用光学显微镜观察,单克隆抗体间接免疫荧光试验和小鼠感染试验进行鉴定.结果显示,该地区犊牛感染的隐孢子虫主要为小型隐孢子虫(Cryptosporidium parvum),这一结果为该地区隐孢子虫病的防治提供了科学依据,同时为开展隐孢子虫病的研究提供了新的分离株.这是国内首次应用单克隆抗体技术和免疫荧光技术鉴定小隐孢子虫卵囊.
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关于人源隐孢子虫排卵规律的探讨
目的 探讨昆明小鼠在免疫抑制和非免疫抑制条件下,感染相同剂量3株人源隐孢子虫分离株的排卵规律.方法 饮水中加地塞米松(DEX) 抑制小鼠免疫功能, 人工灌胃隐孢子虫卵囊(CSO)感染小鼠,观察小鼠粪便中CSO排出规律和小鼠临床表现.结果 1号和2号分离株感染小白鼠后的排隐孢子虫卵囊规律几乎一致,二者与3号分离株感染小白鼠后的排隐孢子虫卵囊规律差别较大.结论 可见能够感染人的隐孢子虫的虫种具有广泛性,这些研究结果,为进一步了解隐孢子虫的人畜互传途径和隐孢子虫病的防治提供了重要的理论依据,并为人源隐孢子虫病的分子流行病学研究打下了良好基础.
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不同剂量隐孢子虫感染正常和免疫抑制小鼠的效应研究
目的 探讨昆明小鼠在灌服地塞米松、地塞米松+隐孢子虫卵囊(150万)、地塞米松+隐孢子虫卵囊(300万)的免疫功能的变化.方法 采用MTT法检测40只昆明小鼠的免疫功能.随机分组:空白对照组(n=10),免疫抑制组(n=10),免疫抑制+隐孢子虫卵囊150万(n=10),免疫抑制+隐孢子虫卵囊300万(n=10).结果 实验组小鼠与对照组小鼠比较,巨噬细胞吞噬功能明显降低,T、B淋巴细胞的增殖明显降低,NK细胞活性均明显降低(p<0.01).结论 40只昆明小鼠吞噬功能、脾细胞增殖、NK细胞活性检测结果见表(1-3),从表中可以看出,实验组小鼠与对照组小鼠三项检测指标比较均有明显降低,差异显著(P<0.01),实验组小鼠各组间比较,差异无显著性(P>0.05).