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FQ-PCR和金标法检测不孕不育夫妇沙眼衣原体的比较分析
目的:探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)在不孕不育诊断和治疗中的作用.方法:采用FQ-PCR和金标法检测60对不孕不育夫妇的女性宫颈分泌物、男性精液或前列腺标本中的沙眼衣原体并将两种方法进行比较.结果:FQ-PCR检测不孕不育夫妇中男、女沙眼衣原体阳性率为46.7%、55.0%,而金标法分别为26.7%、30.0%,差异均有显著性(P＜0.05和P＜0.01).结论:FQ-PCR较金标法更敏感,是诊断不孕不育沙眼衣原体感染更有价值的方法.
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荧光定量PCR检测儿童非典型EB病毒感染的临床评价
目的 探讨荧光定量PCR检测对诊断和治疗非典型EB病毒(EBV)感染的临床意义.方法 对2007-04-2009-10诊断为非典型EBV感染90例患儿,抽静脉血2 ml,注入枸橼酸钠抗凝剂与静脉血充分混匀,用核酸扩增荧光PCR法测定基因拷贝数,同时进行常规外周血及异型淋巴细胞检查,对照病因和首发临床表现,分析儿童感染非典型EBV时荧光定量PCR检测的基因拷贝数变化.结果 EBV-DNA拷贝数能早期反映出非典型EBV感染,拷贝数越高,出现多器官损害概率越高.结论 荧光定量PCR检测EBV-DNA拷贝数有助于早期诊断非典型EBV感染,能减少诊疗的盲目性,对临床有一定指导意义.
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血清曲霉菌游离DNA定量PCR检测方法的建立及应用初探
目的 建立并评价从血清中检测曲霉游离DNA的定量PCR方法.方法 合成曲霉28s rDNA基因特异广谱引物和Taqman探针,建立定量PCR检测方法,并进行方法学评价.用建立的方法检测33例患者的GM阳性血清标本.结果 定量PCR方法灵敏度为2拷贝/反应,标准曲线Y=-3.629X+40.187,相关系数R2为0.997 6.定量PCR方法检测33例患者的首次GM阳性血清标本,对诊断侵袭性曲霉感染的敏感性84％(21/25)、特异性87.5％(7/8)、阳性预测值95.5％(21/22)、阴性预测值63.6％(7/11).PCR阳性与PCR阴性病例组间侵袭性曲霉感染诊断率有统计学差异(95.5％ vs 36.4％),PCR阳性与侵袭性曲霉感染诊断有相关性(RR=2.625).结论 血清曲霉游离DNA定量PCR检测有助于侵袭性曲霉感染的早期诊断.
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梯度PCR在基因扩增研究中的应用
目的:探讨和尝试一种较为迅速确定佳退火温度的方法来扩增目的基因.方法:采用梯度PCR对醛固酮合酶基因(CYP11B2)进行扩增,通过凝胶呈像技术判断CYP11B2基因佳退火温度.结果:与普通PCR相比,梯度PCR能够迅速地确定CYP11B2基因的佳退火温度.结论:梯度PCR简单、直观、快速,适用于各种核酸分子的扩增,具有高效率、高通量的优点,有着广阔的应用前景.
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Real-time PCR技术结合浓缩涂片染色法用于结核病快速诊断的研究
目的:评价Real-time PCR技术结合浓缩涂片染色法对结核病快速诊断的应用价值.方法:应用Real-time PCR技术结合浓缩涂片染色法组合测定1 052份临床标本,并与直接涂片法、BACTEC MGIT-960快速培养法结果进行比较.结果:Real-time PCR技术结合浓缩涂片染色法的阳性检出率30.6%,显著高于直接涂片法的19.2%(χ2=36.6,P<0.01),而接近于BACTEC-960培养法的34.9%(χ2=2.5,P>0.05),而且检测时间明显缩短为4 h;以BACTEC MGIT-960培养鉴定结果为标准评价,Real-time PCR技术结合浓缩涂片染色法的敏感性为89.7%(280/312),特异性为94.3%(698/740),符合率为93.0%(978/1 052).结论:Real-time PCR技术结合浓缩涂片染色法用于结核分枝杆菌检测快速简便,具有很高的敏感性和特异性,在结核病早期诊断中有重要的临床价值.
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结肠癌患者实时荧光定量RT-PCR检测门静脉血CK19 mRNA水平及其临床意义
目的:探讨细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CKl9)mRNA在结肠癌术中患者门脉血中的表达及临床意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测CKl9mRNA在结肠癌手术中患者门脉血中的表达,随访并记录术后24个月时患者的生存情况.结果:90例结肠癌患者门脉血CKl9 mRNA阳性者62例,阳性率为66.7%;结肠癌组织CKl9 mRNA的表达与分化程度、Dukes分期有相关性(分别rs=O.280,P=O.008;rs=0.367,P
关键词： 结肠肿瘤/病理学/血液 聚合酶链反应/方法 角蛋白/血液/遗传学 RNA 信使 门静脉 人类 -
Allo-HSCT患者血浆IL-17和IL-23与aGVHD相关性分析
目的:异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)患者移植前后血浆中IL-17、IL-23浓度与急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)相关性分析.方法:采用双夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中IL-17和IL-23浓度,采用逆转录聚合酶链反应法(Realtime-PCR)检测IL-17 mRNA和IL-2 mRNA相对表达量.结果:1)移植后aGVHD阴性组和aGVHD阳性组患者在性别、年龄、疾病类型、组织类型和预处理方案差异均无统计学意义,P＞0.05.2)各组血浆中IL-17与IL-23浓度检测结果,aGVHD阳性组IL-17的浓度为(330.0±11.5) ρg/mL,显著高于对照组的(109.6±7.6) ρg/mL和aGVHD阴性组的(243.1±16.4) ρg/mL,P值均＜0.001;aGVHD阳性组IL-23的浓度为(250.6±14.3) ρg/mL,显著高于对照组的(101.5±9.6) ρg/mL和aGVHD阴性组的(111.0±16.3) ρg/mL,P值均＜0.001.3)aGVHD阳性组血浆中IL-17与1I-23浓度检测结果,aGVHD发生当天血浆中IL-17的浓度为(330.0±11.5) ρg/mL,IL-23的浓度为(250.6±14.3) ρg/mL,显著高于aGVHD发生前2周和aGVHD发生后1、2和3周IL-17和IL-23的浓度,P值均＜0.05.IL-17、IL-23的浓度在aGVHD发生当天达到高峰,随着症状的控制,逐渐下降.4)aGVHD阳性患者IL-17 mRNA的相对表达量为,3.232±1.137,显著高于对照组的1.432±0.954和aGVHD阴性组的1.672±0.896,P值均＜0.001;aGVHD阳性患者IL-23 mRNA的相对表达量为2.142±1.194,显著高于对照组的1.242±0.752和aGVHD阴性组的1.496±0.653,P值均＜0.001.结论:Allo-HSCT后血浆中IL-17、IL-23与aGVHD的发生呈正相关,动态检测allo-HSCT后IL-17和IL-23浓度的变化,可能为临床上预测或诊断aGVHD的发生提供预警或依据.
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血浆及其外周血单个核细胞中丙型肝炎病毒检测比较
目的:了解慢性丙型肝炎患者的血浆及其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的存在及存在形式.方法:反转录多聚酶链反应(reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测124例慢性丙型肝炎患者的血浆及PBMC中的HCV.结果:在70例抗-HCV及血浆HCV RNA阳性的患者中有21例(30%)的患者其PBMC内存在HCV RNA正链,仅1例存在HCV RNA负链.在54例抗-HCV阳性、血浆HCV RNA阴性的患者中,仅有2例(3.7%)检出HCV RNA正链,未检出HCV RNA负链,这2例患者均为干扰素治疗3～6个月的病人.结论:PBMC可作为肝外病毒复制场所.对慢性HCV感染者来说,3～6个月的干扰素治疗时间可能是不够的,HCV在PBMC内的存在可能是干扰素治疗后复发的原因之一.
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肠道病毒RNA RT-PCR检测在病毒性心肌炎诊断中的应用
目的探讨RT-PCR方法在肠道病毒感染诊断中的应用.方法根据肠道病毒5'非编码区和VP2基因区共同序列设计一对引物,建立了检测各型肠道病毒的RT-PCR方法.用该方法扩增已知病毒,并用于临床标本检测.结果所检测的11种已知病毒中,只对肠道病毒的9个型别扩增.186例心肌炎患者血清标本中,52例(27.95%)阳性.15例脑炎患者脑脊液标本中,4例(26.67%)阳性.结论该RT-PCR方法具有肠道病毒特异性,在肠道病毒感染的诊断中有一定应用价值.
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急性髓系白血病H-ras、凋亡及多药耐药的研究
目的研究急性髓系白血病(AML)H-ras/P21、抗凋亡基因(bcl-2)、细胞凋亡与多药耐药基因(mdr-1/P-gp)对疗效的影响,并证实流式细胞术(FCM)检测P-gp和逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测mdr-1 mRNA间的相关.方法用FCM检测85例初治AML患者的H-ras/P21、bcl-2、细胞凋亡和mdr-1产物P-gp的表达;用RT-PCR检测其中47例的mdr-1/ mRNA.结果 P21+/P-gp+者完全缓解(CR)率明显低于P21-/P-gp-者(分别为58.1%和100%,P<0.025),高bcl-2/P-gp+的CR率明显低于低bcl-2/P-gp-者(分别为60%和96.3%,P<0.005).Pgp+ 31例中29例mdr-1 mRNA阳性,P-gp- 16例中仅2例mdr-1 mRNA阳性.结论 P-gp+同时P21+、高bcl-2者CR低,FCM检测P-gp和RT-PCR检测mdr-1 mRNA相关性良好.
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荧光定量检测在乙型肝炎中的应用
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术已广泛用于核酸分析，它可使极微量单拷贝的特定核苷酸片段在短时间内扩增上百万倍[1]而有利于检测。
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大连地区类风湿关节炎遗传易感性与人类白细胞抗原-DRB1基因的相关性及相关因素分析
目的:探讨人类白细胞抗原-DRB1基因与类风湿性关节炎遗传易感性的相关性,类风湿性关节炎患者红细胞沉降率、类风湿因子、C反应蛋白的变化与人类白细胞抗原-DRB1是否存在关联.方法:随机(隐匿分配)选择2000-02/06在大连医科大学附属第一医院住院及门诊类风湿性关节炎患者41例作为实验组.对照组为同地区的92名健康体检者.利用微量聚合酶链反应-序列特异性引物技术对人类白细胞抗原-DRB1基因进行检测;应用免疫透射比浊法对类风湿因子、C反应蛋白进行检测;应用常规魏氏法检测红细胞沉降率.结果:两组均按实验要求进入结果分析.实验组人类白细胞抗原-DRB1基因的等位基因DRB1*0405的发生频率59%明显高于正常对照组人群26%,相对危险度为4.00,而其他等位基因的发生频率在两组基本相似.而人类白细胞抗原-DRB1*0405+类风湿性关节炎患者(n=24)的类风湿因子水平明显高于人类白细胞抗原-DRB1*0405(n=17)[(73.4±20.3)U/mL,(14.0±7.2)U/mL,t=10.25,P＜0.01];前者的C反应蛋白水平也明显高于后者[(29.1±6.5)g/L,(3.2±1.5)g/L,t=5.66,P＜0.01].结论:大连地区类风湿性关节炎患者易感基因亚型为人类白细胞抗原-DRB1*0405,类风湿性关节炎患者类风湿因子、C反应蛋白指标的变化与人类白细胞抗原-DRB1*0405的表达有关.
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8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化
目的:构建蛋白质转导结构域8个精氨酸聚合体(8R)与MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体,并表达、纯化出具有生物学活性的8R-MUC1核心肽融合蛋白.方法:以PCR法从HSP65-MUC1-pET28a质粒中钓取MUC1核心肽2个重复序列片段,连入pMD18-T载体,然后用酶切、连接的方法从T载体上获得MUC1核心肽6重复序列片段(MUCPT),将其克隆入含8R的pET26b+原核表达载体中构建8R与MUCPT融合蛋白(8R-MUCPT)表达载体.用IPTG诱导转化8R-MUCPT表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化8R-MUCPT融合蛋白.结果:构建了8R与MUC1核心肽6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R-MUCPT-pET26b+,并在BL21(DE3)中表达了8R-MUCPT融合蛋白,经镍螯合层析获得纯度为95.5%的8R-MUC1核心肽融合蛋白.结论:构建了8R-MUC1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白.
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p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建
目的:定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体.方法:以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,后将扩增片段克隆入pcDNA3.1载体中.结果:在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸(cgc)突变为组氨酸(cac),第248位密码子由精氨酸(cgg)突变为色氨酸(tgg),第273位密码子由精氨酸(cgt)突变为组氨酸(cat).p53基因突变子表达载体成功构建.结论:PCR技术诱导定点突变准确、高效.基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点奠定了基础.
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人转化生长因子β3的构建
目的:获取人转化生长因子β3的编码基因,开发抗衰老的皮肤药物.方法:采用重叠PCR的方法,设计4对引物,进行4次PCR合成人转化生长因子β3的编码基因.结果:4次PCR后,经2%的琼脂糖凝胶电泳可见一357 bp的条带,将电泳产物回收,连接入pMD-18T载体,经测序分析证实,所获得DNA片段为人转化生长因子β3的编码基因.结论:利用重叠PCR方法能够成功构建人转化生长因子β3的编码基因.
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网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157:H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌
目的:建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157:H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法.方法:设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针,确定网状分枝扩增方法(RAM)的灵敏度;含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46:H38、O22:H8、O111:NM,用于RAM特异度的测定.用RAM检测所有分离的菌株,并进一步对瞬时RAM进行研究.结果:RAM低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株,表明RAM与PCR具有一样的灵敏度.特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性,而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性.在32株菌株中,28株细菌含有stx2基因,其余则为阴性,与PCR检测结果100%一致.瞬时RAM结果也表明低能检测10个细菌,检测信号的出现依赖于样品的浓度.结论:RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157:H7和STEC.
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人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体.结果:PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中.结论:成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec.
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慢性非细菌性前列腺炎患者生殖支原体感染的检测及意义
目的:探讨生殖支原体(Mg)在慢性非细菌性前列腺炎发病中的作用.方法:采用培养法及聚合酶链反应(PCR)技术检测987例慢性非细菌性前列腺炎患者的前列腺液Mg,并与正常对照组125例进行比较.结果:①在987例慢性非细菌性前列腺患者的前列腺液标本中Mg阳性302例(31.5%),其中153例并发其他病原体感染,以并发解脲支原体(Uu)多见(128例);②125例正常人前列腺液标本中Mg阳性3例(2.53%),两组阳性率比较差异有显著性(x2=44.32,P<0.01).结论:慢性非细菌性前列腺炎患者的Mg感染率高,Mg可能是慢性非细菌性前列腺炎发病的原因之一.
关键词： 前列腺炎/病因学 慢性非细菌性前列腺炎 支原体感染 聚合酶链反应/方法 -
MT1X基因多态性与2型糖尿病的关系
目的:探讨金属硫蛋白(MT)1X基因多态性与中国汉族人群中2型糖尿病(T2DM)发病的关系.方法:采用PCR技术和限制性片段长度多态性(RFLP)的方法检测132例糖尿病患者和137名正常对照者的MT基因家族中的MT1X基因(rs4531729)501T→C突变,统计各组对象的突变频率.结果:糖尿病组和正常对照组MT1X基因(rs4531729)501C→T突变型等位基因(C)频率差异无显著性(x2=1.508,P>0.05);两组间的CC、CT和TT 3种基因型频率分布差异无显著性(x2=1.581,P>0.05).结论:MT1X(rs4531729位点)突变型等位基因与T2DM的发生无关联性.
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KCNJ10基因多态性与精神分裂症的关系
目的:探讨KCNJ10基因多态性与精神分裂症的关系.方法:应用PCR-RFLP方法在90个中国北方汉族精神分裂症患者及其健康父母双亲组成的核心家系中检测单核苷酸多态性(SNP)rs1186679位点的基因型.结果:rs1186679基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律;单倍型相对风险分析(HRR)结果显示rs1186679位点与精神分裂症无关联(x2=0.775,P>0.05);传递不平衡检验(TDT)结果表明,杂合父母传递给受累子女与非传递等位基因频率分布差异无显著性(x2=1.025,P>0.05).结论:在中国北方汉族人群中KCNJ10基因位点上的rs1186679与精神分裂症可能无关联.
