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HIV-1 gp120蛋白对人血-视网膜屏障细胞的毒性作用
目的 探索HIV-1 gp120蛋白侵犯人血.视网膜屏障的机制.方法 原代培养人血-视网膜屏障细胞(HBRBC),包括人视网膜微血管内皮细胞(HRCEC)、人视网膜微血管周细胞(HRCPC)、人视网膜色素上皮细胞(HRPE),以培养基作为对照.用MTT法观察7种不同浓度(0.01～0.15 mg/L)的HIV-1 gp120蛋白作用24 h和0.08 mg/L HIV-1 gp120蛋白作用不同时间(4～72 h)对3种细胞的生长抑制作用.0.08、0.1、0.12、0.15 mg/L的HIV-1 gp120蛋白作用24 h后,用流式细胞仪检测其对3种细胞凋亡率和线粒体膜电位(△ψm)的影响;用Western免疫印迹检测Cleaved cagpase-9蛋白的活化情况.用透射电镜观察经0.08 mg/L HIV-1 gp120蛋白处理24 h前后3种细胞超微结构的变化.结果 HIV-1gp120蛋白作用24 h,低浓度(<0.08mg/L)对3种细胞的活性均没有明显影响,而当浓度超过0.08mg/L时,对细胞的增殖活性有明显的抑制作用,呈浓度依赖性(HRCEC:r=-0.763,P<0.01;HRCPC:r=-0.804,P<0.01;HRPE:r=-0.698,P<0.01).HIV-1 gp120蛋白(0.08mg/L)作用12 h即可显著抑制细胞的增殖活性.24、48和72 h抑制效应更明显,相对增殖率分别为HRCEC:84%、70%、41%、22%,HRCPC:80%、69%、38%、18%,HRPE:86%、73%、45%、26%,抑制效应呈时间依赖性(HRCEC:r=0.833.P<0.01;HRCPC:r=-0.784,P<0.01;HRPE:r=-0.701,P<0.01).HIV-1 gp120蛋白作用24 h后与对照组相比,各浓度组3种细胞凋亡率增加、△ψm明显降低以及Cleaved cagpase-9蛋白表达增强,均呈浓度依赖性.透射电镜示0.08mg/LHIV-1 gp120蛋白处理24h后,3种细胞均出现了线粒体肿胀、溶酶体增多等早期凋亡的微观改变.结论 HIV-1 gp120蛋白能够抑制人血-视网膜屏障细胞的增殖并具有诱导凋亡的作用,破坏线粒体的结构和功能是其可能的机制.
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炭疽保护性抗原受体结合区的关键氨基酸位点分析
目的分析炭疽毒素保护性抗原(PA)受体结合区与其功能相关的关键氨基酸位点.方法通过定点突变的方法将PA的Asp683分别突变成为一系列带有不同电荷以及不同长度侧链的氨基酸,通过细胞毒性实验分别探询电荷及立体结构对其活性的影响.同时对Asp683的一些邻近氨基酸进行了定点突变的研究.结果细胞毒性实验显示,不同的突变导致了PA活性不同程度的下降,其中Asp683电荷的改变对其活性的影响尤为明显,但当它突变为不带电荷的氨基酸时,PA仍然保留了一定的活性;而当Asp683突变为带正电的Lys后,PA却保留了相对较高的活性.结论 Asp683所带的负电荷在PA与其受体的相互作用中起着关键的作用,但PA与其受体之间的相互作用可能还通过一些其他方式进行.
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血管内速溶支架的细胞毒性和植入实验研究
目的:检测一种新型的血管内速溶支架的生物相容性.方法:分别对血管内速溶支架进行细胞毒性实验和皮下植入实验.细胞毒性实验:速溶支架粉末与L929细胞接触培养,倒置显微镜观察形态,采用MTT(四唑盐)比色法量化细胞毒性,并进行毒性分级.皮下植入实验:在12只新西兰白兔右侧背部皮下植入血管内速溶支架,左侧作为空白对照,分别于植于支架后3、7、14、28 d,肉眼和镜下观察植入点炎症反应情况.结果:血管内速溶支架细胞毒性为0级.皮下植入后无炎症反应,局部组织无刺激.结论:该课题组黏合吻合血管用血管内速溶支架材料满足ISO 10993要求,具有良好的生物相容性.
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羟基磷灰石涂层钛合金材料生物相容性研究初探
目的：探讨一种新型的代骨材料--羟基磷灰石涂层的钛合金材料的生物相容性。方法制备羟基磷灰石涂层钛合金材料浸提液后，采用细胞毒性实验以观察实验样品浸提液对L929小鼠成纤维细胞的毒性反应；通过对小鼠尾静脉及腹腔注射试验样品浸提液后，观察其对小鼠的急性全身毒性反应；Ames实验及迟发型超敏反应实验对其遗传毒性及致敏性进行安全性评价。结果羟基磷灰石涂层钛合金材料浸提液对L929小鼠成纤维细胞的相对增殖率（RGR）为96.9%，细胞毒性反应为1级，无细胞毒性反应；对小鼠亦无明显的急性全身毒性作用，实验样品组与阴性对照组动物体质量差异无统计学意义（P＞0.05）；遗传毒性Ames实验表明，在活化与非活化条件下，该材料浸提液对鼠伤寒沙门氏菌株的回变菌落数与对照组比均未增加2倍，对该菌株无诱变性；迟发型超敏反应实验显示，该材料浸提液无潜在的皮肤接触致敏性。结论羟基磷灰石涂层的钛合金材料具有良好的生物相容性。
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柳叶洗眼液毒理学实验研究
目的建立柳叶洗眼液的细胞和动物毒性实验,探讨其用药安全性.方法取新鲜柳叶,采用水提、醇沉、超滤、灭菌等工艺制成柳叶洗眼液.观察柳叶洗眼液对猴胚肾(MEK)细胞毒性实验、白兔眼刺激性实验及豚鼠皮肤过敏实验的影响.结果柳叶洗眼液对MEK细胞的大无毒浓度为1/4原液浓度,对白兔眼无任何刺激,且对豚鼠无任何皮肤过敏反应.结论本实验证实了柳叶洗眼液液的安全性,为该制剂的临床应用开发提供了实验依据.
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黑色素为基础的新型纳米基因载体的制备及毒性初步评估
目的 探讨黑色素纳米颗粒(MNP)经聚赖氨酸(PLL)改性连接小干扰RNA(siRNA)后的细胞毒性,为其在基因治疗中的应用提供依据.方法 制备新型水溶性MNP并经PLL螯合改性,依靠静电作用连接siRNA,分别与4T1乳腺癌细胞和Hep2喉癌细胞进行孵育,采用CCK8检测法观察细胞生长状况,并对材料的细胞毒性进行分级.结果 4T1乳腺癌细胞和Hep2喉癌细胞在1000μg/ml及其以下的实验分组中均生长良好,形态饱满.CCK8检测法数据表明细胞生存率均大于80％,毒性分级达合格.结论 MNP经PLL改性连接siRNA所形成的复合物是一种生物安全性高,毒性小的新型纳米基因载体.
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新西兰雌-雄兔皮肤移植模型体内细胞毒性实验
背景:建立一种有效的评估模式来监测移植后受者免疫状态是当前的难点.目的:建立兔体内细胞毒性实验方法,验证体内细胞毒性实验能否检测出受体的免疫排斥状况.方法:建立新西兰白兔雌-雄兔皮肤移植模型,另设未作移植的雌、雄兔为对照组.取雌兔及雄兔脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度活细胞染料羟基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色后制备1∶1混合细胞悬液.雄兔输注混合细胞后分别于1,2,4,8 h 抽取外周血,流式细胞仪检测外周血两种荧光细胞的比例变化,计算供体特异性细胞杀伤率.结果与结论:雌-雄兔皮肤移植排斥模型在皮肤移植2周后可建立,混合细胞悬液输注后在模型组和对照组外周血中的比例变化不同,雄兔输注混合细胞后1,2,4,8 h的杀伤率模型组高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.01).提示体内细胞毒性实验可用于免疫状态监测,可以直观地反映皮肤移植模型的体内特异性免疫环境及移植物所受的免疫攻击强度.
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NK细胞杀瘤活性与肿瘤细胞表面MICA/B表达的相关性研究
目的 探讨自然杀伤NK细胞杀瘤活性与肿瘤细胞表面MICA/B表达的相关性.方法 采用流式细胞术检测人红白血病细胞K562、乳腺癌细胞Bcap37、肾癌细胞769P及肺癌细胞A549表面MICA/B的表达,RosetteSep~((R))改进法分离人外周血NK细胞.MTT法检测不同效靶比时NK细胞对几种肿瘤细胞的杀伤活性.结果 K562、Bcap37、769P及A549细胞表面MICA/B的表达阳性率分别是(60.35±0.50)%、(90.72±0.64)%、(55.59±0.55)%、(3.84±0.10)%;RosetteSep~((R))改进法分选出的NK细胞纯度为(96.52±2.42)%,在同一效靶比时,NK细胞对K562、Bcap37及769P的杀伤活性较强,与A549相比有显著性差异(P＜0.01),其中K562与Bcap37之间无显著性差异(P＞0.05);效靶比为5.1、10:1、20:1时,NK细胞的杀伤活性与4种肿瘤细胞表面MICA/B表达均呈正相关关系(P＜0.01),随着效靶比增加,相关性增强.结论 NK细胞的杀伤敏感性与肿瘤细胞表面MICA/B的表达水平相关,肿瘤细胞表面MICMB的表达水平影响NK细胞的杀伤活性.
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AS2O3对CD34+白血病细胞NKG2D配体表达及NK杀伤活性的影响
目的:观察AS2O3对CD34+早期急性髓系白血病细胞NKG2D配体表达及NK细胞杀伤活性的影响.方法:流式细胞仪检测KGla细胞表面CD34抗原表达率,MTF法确定AS2O3的基本工作浓度,以不同浓度的AS2O3处理KGla细胞,流式细胞仪测定处理前后KGla细胞NKG2D配体的表达情况;MACS法分离5例健康个体的NK细胞,LDH释放法检测NK细胞对AS2O3处理前后KGla细胞的杀伤活性.结果:10 nmol/ml的AS2O3作用KGla细胞后,能使KGla细胞表面ULBP1的表达水平显著上调(P<0.05),同时也激发了NK细胞对KGla细胞的杀伤活性(P<0.05).结论:AS2O3能上调CD34+白血病细胞表面NKG2D配体的表达水平,诱导NK细胞对其的杀伤活性,启示AS2O3可与NK细胞组成过继性免疫化疗方案,提高急性白血病的疗效.
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戊二醛交联时间对人脱细胞真皮基质生物学性质的影响
目的:探讨戊二醛交联时间对人脱细胞真皮基质(ADM)生物学性质的影响.方法:用低浓度戊二醛交联高渗盐-NaOH消蚀法制备的人ADM,根据交联时间的不同分为交联10、 15、 20、 30 min组,大体观察各组的物理性状;免疫组织化学检测各组Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达;MTT细胞毒性实验评价4组ADM的细胞毒性反应;将NIH3T3细胞接种于各组ADM上,比较24 h细胞贴壁数并观察细胞生长情况;将人成纤维细胞与交联10、 15 min组ADM体外复合培养,观察细胞生长和增殖情况.结果:随着交联时间延长,ADM的韧性逐渐增加;各组ADMⅠ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达阳性;ADM细胞毒性反应交联10和15 min组0～1级、20 min组1～2级、30 min组1～3级;交联10、 15 min组分别与20 min组24 h 3T3细胞贴壁数比较有统计学意义;而交联10、 15 min两组间无统计学意义;3T3细胞能够在交联10、 15 min组ADM表面贴附、增殖;免疫荧光法显示鼠抗人波形蛋白抗体呈阳性,有较多的人成纤维细胞黏附于交联10和15 min组ADM上,生长和增殖良好.结论:戊二醛化学交联10～15 min的人ADM蕴涵丰富的生物信息,细胞毒性小,生物相容性好,是一种很好的生物支架材料.
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国产金属烤瓷材料生物安全性的初步评价
目的 初步评价国产金属烤瓷材料的生物安全性.方法 参照国际标准化组织7405技术报告牙科材料的生物学评价检验标准,对国产金属烤瓷材料的生物相容性进行了初步的评价,包括经口短期全身毒性试验、溶血试验及细胞毒性试验(琼脂覆盖法).结果 国产金属烤瓷材料无经口短期全身毒性反应;材料溶血率为1.177%,不会引起急性溶血;无细胞毒性.结论 国产金属烤瓷材料生物安全性的初步评价合格,可进行更进一步的生物安全性试验.
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同种异型抗CD3单抗对细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增的影响
目的 探讨同种异型抗CD3单克隆抗体(UCHT1、OKT3)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖、表型及细胞毒功能的影响.方法 分离7位健康志愿者外周血单核细胞,IFN-y培养24h后分别加入UCHT1(VCHT1组)、OKT3(OKT3组)及IL-1a、IL-2体外培养,于培养第3、7、10、12、14和21天比较扩增倍数；并选取培养第14天的细胞采用流式细胞仪分析CD3、CD8和CD56分子的表达,比较CIK细胞对K562细胞系的细胞毒作用.结果 培养第10、12、14、21天OKT3组扩增倍数显著高于UCHT1组(P均＜0.05)；平均CD; CD;阳性细胞频数在培养第14天明显高于UCHT1组(P＜0.05),平均CD+56细胞频数UCHT1组高于OKT3组(P＜0.05)；平均CD+3CD+56细胞频数UCHT1组也高于OKT3组,但无统计学差异.对K562细胞的细胞毒作用,UCHT1组有高于OKT3组的趋势(当效靶比为20:1时,P=0.078).结论 在保证细胞扩增倍数的情况下,选择UCHT1更适用于 体外扩增CIK细胞.
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苦参碱提高白血病KG1a细胞对NK细胞杀伤敏感性及其机制
目的 研究苦参碱(Matrine)作用前后白血病KG1a细胞对NK细胞杀伤细胞敏感性的变化,并初步探讨其机制.方法 应用CCK-8法检测苦参碱对KG1a细胞50%抑制量JC50,值,以此量的苦参碱作用于KG1a细胞,LDH释放法检测作用前后对NK细胞的杀伤敏感性.RT-PCR检测KG1a细胞NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)五种基因的表达,流式细胞仪检测作用前后KG1a细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子表达变化.结果 苦参碱作用前后在效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时对NK细胞杀伤敏感性差异均有统计学意义(P<0.05).KG1a细胞在mRNA水平五种基因均表达.苦参碱作用前KG1a细胞表面NKG2D各配体几乎不表迭,作用后各配体显著升高,与作用前相比差异有统计学意义(P<0.05).HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P>0.05).结论 苦参碱能提高KG1a细胞对NK细胞的杀伤敏感性,其机制可能与苦参碱提高KG1a细胞表面NKG2D配体的表达有关.
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VEGF同轴静电纺丝膜的体外血液相容性及生物学活性研究
目的 评价VEGF同轴静电纺丝膜的物理特性、体外血液相容性和生物学活性,探求其作为人工心血管替代材料的可行性.方法 通过静电纺丝技术制备VEGF同轴静电纺丝膜,然后进行体外溶血实验、动态凝血实验、凝血时间测定、血小板粘附实验、细胞毒性实验、体外细胞粘附实验对其血液相容性和生物学活性进行评价,并与涤纶(Dacron)作平行对照.结果 VEGF同轴静电纺丝膜的血液相容性较高,经统计学分析与Dacron之间差异无统计学意义(P＞0.05).VEGF同轴静电纺丝膜的体外细胞粘附实验中,经细胞计数Dacron为(5.34±0.94)×103,PCL-PEG静电纺丝膜为(7.82±0.85)×104,PCL-PEG/BSA同轴静电纺丝膜为(8.04±0.84)×104,PCL-PEG/BSA-VEGF同轴静电纺丝膜则为(1.39±0.76)×105,经统计学分析PCL-PEG静电纺丝膜和PCL-PEG/BSA同轴静电纺丝膜之间差异无统计学意义(P＞0.05),PCL-PEG静电纺丝膜和PCL-PEG/BSA同轴静电纺丝膜与Dacron之间差异有统计学意义(P＜0.05),而PCL-PEG/BSA-VEGF同轴静电纺丝膜与PCL-PEG静电纺丝膜和PCL-PEG/BSA同轴静电纺丝膜之间的差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 VEGF同轴静电纺丝膜血液相容性较高,且更易于与内皮细胞粘附,显示其成为人工心血管替代材料的前景.
关键词： VEGF同轴静电纺丝 血液相容性 细胞毒性实验 生物学活性 -
小檗碱对U251胶质瘤干细胞的诱导分化作用
目的：研究小檗碱对胶质瘤干细胞（GSC）分化的影响。方法用CD133免疫磁珠法由U251胶质瘤细胞中分选培养GSC，并用流式细胞术进行验证；细胞毒性实验评价小檗碱对GSC生长的抑制作用，采用不同浓度小檗碱（0.001、0.01、0.1、1μmol/L）作用于GSC，测量其吸光度值（OD）；用RT-PCR、免疫荧光法检测干细胞标记物CD133、Nestin及细胞分化标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）的表达水平。结果免疫磁珠法分选后CD133+细胞比例超过98%，无血清培养条件下能形成干细胞球。细胞毒性实验显示：小檗碱对GSC生长的抑制作用随剂量和时间的增加而增强。RT-PCR检测显示：随时间延长，小檗碱可使干细胞标记物CD133、Nestin基因的mRNA表达水平逐步降低，而细胞分化标记物GFAP、MAP2基因的mRNA表达水平逐渐升高。免疫荧光法检测显示：小檗碱能抑制CD133、Nestin蛋白的表达，上调GFAP、MAP2蛋白的表达。结论小檗碱能有效抑制GSC生长，并诱导其分化。
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NKG2D配体在13种肿瘤细胞系中的表达及意义
背景与目的:NKG2D及其配体的相互作用在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用.本研究探讨NKG2D配体在13种肿瘤细胞系中的表达及其意义.方法:采用半定量RT-PCR法检测肿瘤细胞系中NKG2D配体的mRNA表达.应用MTT法检测人NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,免疫组织化学技术和Western blot法检测肿瘤细胞中MHC I类相关蛋白A(MHC class Ⅰ chain-related A)蛋白表达情况.结果:13种肿瘤细胞系表达不同水平的NKG2D配体mRNA.其中Hep2细胞中MICA强阳性表达,HeLa、HepG2、MDA231、HT29、SGC7901、M21、K562、Jurkat细胞MICA表达阳性,而Caski、PG、HL-60和Raji细胞中MICA mRNA阴性.MICA和MICB的表达水平与NK细胞杀伤活性具有高度相关性(r=0.851,P＜0.001;r=0.652,P＜0.05).除ULBP3外,其余ULBP成员的表达水平与NK细胞杀伤均无相关性.结论:在6种人NKG2D配体中,MICA的表达水平与肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性关系为密切,肿瘤细胞MICA的表达水平可能决定着机体NK细胞抗肿瘤免疫应答的强弱.
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姜黄素提高白血病KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性及其分子机制探讨
目的:研究姜黄素作用前后白血病KG1a细胞对同种异体自然杀伤(NK)细胞杀伤的敏感性变化,并初步探讨其分子机制.方法:以对同种异体NK细胞杀伤高度敏感的白血病K562细胞为对照,乳酸脱氢酶释放法检测KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测细胞表面NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3)和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达,逆转录PCR法检测细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因mRNA的表达水平.CCK-8法检测姜黄素对KG1a细胞半数抑制量(IC50),以此含量作用KG1a细胞,再次乳酸脱氢酶释放法检测姜黄素作用后的KG1a对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测姜黄素作用后的KG1a细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达水平.结果:与K562细胞比较,KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤呈低度敏感,KG1a细胞表面NKG2D各配体蛋白表达阳性率均明显低于K562细胞(P＜0.01),HLA-Ⅰ蛋白表达阳性率则明显高于K562细胞(P＜0.01)；在mRNA水平两种白血病细胞表面均有NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因表达.当效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时,姜黄素作用后NK细胞对KG1a细胞杀伤率明显高于作用前(P＜0.01)；作用后KG1a细胞各NKG2D配体表达率均明显升高(P＜0.05或0.01),HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P＞0.05).结论:姜黄素能提高KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,其机制可能与姜黄素提高KG1a细胞表面NKG2D配体的表达有关.
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纯钛种植体表面不同化学组成的TiO2涂层细胞毒性实验研究
对纯钛表面不同化学组成的Ti02涂层可能存在的潜在细胞毒性进行研究,为该材料应用于临床提供实验依据.方法:参照GB/T16886和国家医药管理局颁布的行业标准YY/T 0127的评价标准和要求,采用规定的L929细胞,经材料浸提液与细胞共培养方式对纯钛表面不同化学组成的TiO2涂层进行细胞毒性测试,采用MTT比色法,测定各组1、3、5天L929细胞的相对增殖率来判别材料对细胞的毒性程度,并进行统计学分析比较.结果:各实验组与阴性对照组两两比较对L929细胞的增殖差异均无显著性意义(P＞0.05);各实验组与阳性对照组进行两两比较差异有显著性意义(P＜0.05)；细胞毒性为1级.结论:该TiO2涂层与L929细胞相容性好,参照GB/T16886和YY/T 0127标准属于安全范围.
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MTT法评价4种医用材料的细胞毒性
目的 研究4种医用材料的细胞毒性.方法 按照GB/T16886.5-2003/ISO10993-5:1999的体外细胞毒性评价方法要求,用MTT比色法评价4种医用材料的细胞毒性.结果 4种医用材料均表现出较高的细胞相对增殖率,其细胞毒性为1级.结论 4种医用材料对细胞形态、生长和增殖不构成损害,无明显细胞毒性,具有良好的细胞相容性.
