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利用Red重组系统在腺病毒大质粒上快速实现单碱基点突变
目的 在包含腺病毒全基因组40 kb的大质粒上快速实现单碱基突变.方法 通过重叠PCR方法扩增出含有突变位点的打靶DNA,将腺病毒大质粒和打靶DNA共同转化入Red高重组率大肠杆菌中,通过菌落PCR联合酶切鉴定的方法,筛选到携带突变位点大质粒的菌株.并将得到的突变大质粒再次转化入质粒高稳定菌株DH10B中,以保持质粒骨架的稳定性.结果 通过该法在腺病毒的9171位点和24410位点连续引入了2个单碱基突变.酶切鉴定了骨架质粒的稳定性,测序结果显示突变位点正确.结论 成功建立了一种快速在40 kb的腺病毒大质粒上实现单碱基突变的技术,阳性突变位点检出率在5%~15%,该法的建立为研究腺病毒的毒理作用提供了技术平台.
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利用PCR产物快速构建兔HPRT 基因无启动子打靶载体
目的 探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔 HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础.方法 首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-rHPRT质粒.然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50 bp HPRT 基因同源序列的IRES-eGFPCre-Frt/Neo/Frt同源重组片段,终构建 HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.结果 PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功.结论 成功快速地构建了HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究.
