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负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞对大鼠Th细胞增殖的影响
目的 探讨负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞对大鼠Th细胞增殖的影响.方法 将CTLA4Ig重组腺病毒与Wistar大鼠未成熟树突状细胞于37C共孵育6h后,经尾静脉注射该大鼠作实验组,另外分别设立Wistar大鼠未成熟树突状细胞、CTLA4Ig重组腺病毒、生理盐水经尾静脉注射为对照.1周后,用0.3%戊巴比妥麻醉各组大鼠后抽血检测CTLA4Ig.取脾脏,经流式细胞术分选出Th1、Th2细胞及CD4+T细胞,行混合淋巴细胞培养检测Th细胞的增殖.用免疫组织化学法检测Th1、Th2细胞的比例.结果 实验组血清CTLA4Ig水平(0.654±0.13)显著高于CTLA4Ig重组腺病毒组(0.392±0.10,P＜0.01),树突状细胞组及生理盐水组未检出.实验组Th1细胞的增殖指数(742±161)、Th1/Th2(0.16±0.05)均显著低于各对照组(分别与未成熟树突状细胞组、CTLA4Ig重组腺病毒组、生理盐水组相比,P均＜0.01);而Th2细胞的增殖指数(9162 ±598)显著高于各对照组(P均＜0.01).结论 负载CTLA4Ig重组腺病毒的未成熟树突状细胞可显著抑制大鼠Th1细胞增殖,促进Th2细胞增殖,使Th细胞由Th1向Th2显著偏移,诱导有效的免疫耐受.
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CTLA4Ig转基因治疗器官移植排斥(文献综述)
T细胞活化所致的免疫排斥反应是器官移植的大障碍.CD28-B7共刺激途径在T细胞活化中起主要作用,应用CTLA4Ig以封闭CD28-B7途径可明显延长移植器官的存活.本文综述CTLA4Ig转基因治疗的方法、效果及其机制.
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CTLA4Ig基因转染猪皮治疗中小面积浅Ⅱ度烧伤创面的随机对照试验
目的 探讨CTLA4Ig基因转染猪皮治疗中小面积浅Ⅱ度烧伤创面的临床疗效与安全性.方法 将自2005年5月～2007年5月我院收治的浅Ⅱ度烧伤患者60例随机分为2组,每组30例.基因转染猪皮治疗组:伤后创面简单清创,去除水疱,用复温后的基因转染猪皮覆盖创面.对照组:创面简单清创,除颜面、会阴部位创面外,均予包扎治疗,保留水疱皮,其后常规换药治疗.结果 基因转染猪皮治疗组创面愈合时间5～10 d,对照组为8～14 d.基因转染猪皮治疗组疼痛明显减轻,未观察到寒战、高热等全身不良反应及局部排斥反应.两组均未出现瘢痕,但对照组部分病例出现色素改变.结论 应用基因转染猪皮治疗中小面积浅Ⅱ度烧伤创面能明显缩短创面愈合时间,能明显减轻创面疼痛,减少换药次数,预防色素改变及瘢痕形成.
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重组人CTLA4Ig在猕猴体内的药动学研究
目的:研究重组人单克隆抗体CTLA4Ig经静脉单次给药后在猕猴体内的药动学过程,评价剂量与药动学参数之间的关系.方法:9只猕猴分为3组,3组分别单次给药(50,10和2 mg·kg-1),按不同时间点采血分离血清,ELISA法测定血清中CTLA4Ig的浓度,根据非房室统计矩模型用WinNolin药代软件进行曲线拟合并计算药动学参数.结果:猕猴分别静脉单次注射高、中、低(50,10,2 mg·kg-1)CTLA4Ig后,对应的AUC2-inf与剂量呈现线性正相关性,剂量之比为25:5:1,对应的AUC比值为24.99:4.73:1;三个剂量的t1/2和CLs相近,说明在本实验的剂量范围内剂量的变化在猕猴体内对CTLA4Ig的t1/2和CLs没有影响.结论:在本实验的剂量范围内,CTLA4Ig在猕猴体内符合线性药动学特点.
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重组 CTLA4Ig腺病毒对巨噬细胞活性及移植后排斥反应的抑制作用
目的研究重组CTLA4Ig腺病毒对巨噬细胞活性及移植后排斥反应的抑制作用及其初步机制.方法采用大鼠原位肝移植模型,供体移植前7 d应用重组CTLA4Ig腺病毒,移植后动态观察移植物急性排斥反应病理学分级、巨噬细胞浸润程度、细胞凋亡程度、移植物局部及受体外周血IFN-γ水平.结果应用重组CTLA4Ig腺病毒后,CTLA4Ig可以在移植肝局部稳定表达,并在移植术后3,5,7,12 d各时点排斥反应病理分级、移植物局部巨噬细胞浸润和肝细胞凋亡指数均较排斥对照组显著减低(P＜0.01);巨噬细胞浸润与排斥反应分级呈显著相关(r=0.696,P＜0.01).对细胞因子IFN-γ的检测表明,应用重组CTLA4Ig腺病毒后,移植物局部IFN-γ mRNA和蛋白水平明显受抑制,血清IFN-γ浓度在术后5,7,12 d均较排斥对照组低(P＜0.01).结论应用重组CTLA4Ig腺病毒可以抑制IFN-γ表达,抑制巨噬细胞活性,从而减缓移植后急性排斥反应,抑制肝细胞凋亡,保护移植物功能.
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CTLA4Ig腺病毒基因治疗诱导异基因大鼠心脏移植耐受
目的: 通过CTLA4Ig腺病毒基因治疗诱导异基因大鼠之间的心脏移植耐受,并探讨相关机制.方法: 将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠,同时经门静脉输注CTLA4Ig腺病毒(1×109～5×109 pfu*ml-1).通过RT-PCR检测CTLA4Ig的体内表达,观察记录心脏移植物的存活时间,通过MLR、IL-2逆转实验,Th1/Th2型细胞因子表达的检测,研究耐受的机制.结果:用LacZ腺病毒载体(AdLacZ)治疗组,不能延长移植物的存活,用CTLA4Ig腺病毒基因治疗组,DA大鼠的心脏移植物明显延长.RT-PCR实验证明,CTLA4Ig基因在受体内不同的组织表达量有所不同,并且随着时间的推移表达下降.Th1和Th2型细胞因子的检测显示,耐受大鼠体内未发现这两类细胞因子的偏移现象.MLR证明耐受大鼠的免疫应答表现为供体特异性,IL-2逆转实验表明,该耐受与克隆失活有关.结论: 在手术中给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗,可诱导异基因大鼠间的心脏移植耐受,延长心脏移植物存活,该移植耐受表现为供体特异性,其形成与克隆失活有关,未发现Th1/Th2型细胞因子的偏移现象.
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核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建
目的 将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合,研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性.方法 用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因,同时引入核小体Th表位(H2B14-28).将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA4Ih-H2B.将表达质粒转染COS-7细胞,Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达.将构建表达CTLA4Ig-H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB/c小鼠,取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达.结果 酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功.在pcDNA3.1(+)-CTLA4Ig-H2B质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合.重组蛋白在BALB/c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达.结论 成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体.
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体外CD134L单抗或CTLA4Ig对狼疮样BXSB小鼠脾细胞分泌IL-6、IFN-γ及自身抗体的影响
目的:探讨体外CD134L单抗或CTLA4Ig对狼疮样BXSB小鼠脾细胞分泌IL-6、IFN-γ及自身抗体的影响.方法:采用未经治疗的狼疮样BXSB小鼠模型,应用CD134L单抗和/或CTLA4Ig体外特异性阻断CD134-CD134L或B7-CD28通路后,用MTT法测定分裂原刀豆蛋白A(ConA)诱导的脾淋巴细胞增殖反应和用ELISA方法测定ConA诱导的脾细胞培养上清液中IL-6、IFN-γ和抗ds-DNA抗体的表达水平,并与经中药狼疮方或强的松治疗的狼疮样BXSB小鼠模型进行比较.结果:(1)在单纯培养或经ConA刺激后培养,相比于正常对照鼠,狼疮样小鼠脾淋巴细胞都表现有增殖反应性的显著增高,IFN-γ、IL-6蛋白量的增高和抗ds-DNA抗体的过度分泌.(2)经强的松或中药狼疮方体内治疗后,狼疮样小鼠脾淋巴细胞体外培养的增殖反应性及IFN-γ、IL-6的分泌都受到明显抑制,抗ds-DNA抗体的产生也明显减少.(3)体外单独应用CD134L单抗或CTLA4Ig特异性阻断CD134-CD134L或B7-CD28共刺激信号通路,同样可以显著抑制体外培养的狼疮样小鼠脾淋巴细胞的增殖反应及IFN-γ、IL-6的分泌,并可明显减少抗ds-DNA抗体的产生,但它们的抑制作用比强的松、中药狼疮方体内治疗狼疮样小鼠时所表现出的类似效应要弱.(4)联合CD134L单抗和CTLA4Ig,则治疗作用显著提高,其抑制脾淋巴细胞的增殖反应及IFN-γ、IL-6的分泌,抗ds-DNA抗体产生的作用都优于中药狼疮方的体内治疗效果,而与强的松的体内治疗效应相当.结论:CD134-CD134L可以提供独立的、非B7-CD28依赖的,另一种驱动抗原特异性T细胞增殖的协同刺激通路.同时阻断B7与CD28、CD134L与CD134间的相互作用,使自身反应性T淋巴细胞的活化和增殖受到快速而大限度的抑制,对治疗SLE等自身免疫性疾病可能是一种较理想的免疫干预模式.
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CTLA4Ig修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响
目的:探讨CTLA4Ig修饰的DC对实验动物免疫功能的影响.方法:将经CTLA4Ig基因修饰或未修饰DC腹腔注射C57BL/6致敏小鼠,以致敏或未致敏C57BL/6单个核细胞作为反应细胞,以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞,共培养6天,采用MIT比色法检测细胞增殖,乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性.结果:CTLA4Ig融合蛋白对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用.CTLA4Ig修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应均明显降低,CTLA4Ig融合蛋白对CTL细胞毒活性有显著抑制作用.CTLA4Ig修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性均具有抵抗作用,未修饰DC细胞对未致敏小鼠以及未修饰DC对致敏小鼠CTL细胞毒活性敏感.结论:稳定表达CTLA4Ig融合蛋白的DC诱导显著降低同种小鼠淋巴细胞的增殖反应和对CTL细胞毒活性的抵抗.
关键词： 树突状细胞 CTLA4Ig 单向混合淋巴细胞培养 乳酸脱氢酶法 -
腺病毒载体介导的CTLA4-FasL基因转移联合应用供者脾细胞输注促进异基因小鼠皮肤移植耐受
目的:探讨腺病毒介导CTLA4-FasL基因转移联合应用供者脾细胞输注延长小鼠皮肤移植物存活的作用及其机制.方法:在移植的第0天,C57BL/6(H-2b,B6)小鼠经尾静脉注射BALB/c(H-2d)小鼠脾细胞和5×109空斑形成单位/毫升(pfu/ml)CTLA4-FasL重组腺病毒(AdCTLA4-FasL),同一天进行皮肤移植,每天观察移植物存活情况.耐受小鼠尾静脉取血,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定CTLA4-FasL融合蛋白的体内表达;于第20天对受体小鼠进行迟发型超敏反应、单向混和淋巴细胞反应(MLR)、IL-2逆转试验、过继转移实验和嵌合体检测等耐受状态的检测,以探讨耐受机制.结果:经尾静脉输注供体脾细胞及AdCTLA4-FasL的B6小鼠,皮肤移植物的平均存活时间达(42.8±2.6)天(n=6),而对照的未处理组,绿色荧光蛋白(EGFP)腺病毒处理组,重组腺病毒AdCTLA4Ig组和AdCTLA4-FasL处理组的平均存活时间为(10.1±0.41)天(n=6)、(10.5±1.4)天(n=6)、(12.8±1.1)天(n=6)、(20.0±2.5)天(n=6),差异具有显著意义(P＜0.01);皮肤移植物长期存活的受体小鼠对供体抗原的低应答可以通过脾细胞被过继转移;DTH反应受到抑制、MLR活性特异性降低,且可以被外源性IL-2部分逆转.结论:供体脾细胞输注和腺病毒介导CTLA4-FasL基因转移使受体B6小鼠体内高效表达免疫抑制分子CTLA4-FasL,使异基因皮肤移植物长期存活.该效应具有供体特异性,克隆无能是耐受诱导的主要因素.
关键词： 皮肤移植 免疫耐受 CTLA4Ig CTLA4-FasL 基因转移 -
043 转基因诱导移植耐受的研究进展
转基因诱导移植耐受、防止移植物排斥的研究，近年来有了较大进展。转MHC基因诱导移植耐受是一多种机制参与的过程。封闭T细胞活化的共刺激信号诱导耐受应用多的是转CTLA4-Ig基因，其表达产物可与CD28分子竞争性结合B7分子，从而阻断T细胞活化的第二信号。转抑制性细胞因子基因诱导移植耐受，应用广的是IL-10、TGFβ1，其机制是利用该类因子的免疫抑制活性，调节Th1／Th2的平衡。转FasL基因主要是诱导免疫细胞凋亡，其诱导效果的可靠性有待于探讨。
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治疗风湿性疾病的新型药物CTLA4Ig
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-免疫球蛋白(CTLA4Ig)是人工合成的针对B7:CD28共刺激途径的免疫抑制剂,这一制剂被广泛用来抑制多种病理性免疫反应,包括过敏性疾病、移植排斥反应等.关于它在风湿性疾病中的应用近年来已有大量临床研究.本文就这方面的进展作一综述.
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胰岛素和CTLA4Ig共表达基因治疗小鼠糖尿病模型的效果
为观察导入CTLA4Ig基因能否延长胰岛素基因治疗的疗效时间,静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)小鼠模型,将24只造模成功的雄性C57小鼠随机分为注射空载腺病毒组、表达胰岛素的腺病毒组(recombinant adenovirus vector/insulin,rAdV/Ins)和共表达胰岛素和CTLA4Ig基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus vector/insulin-CTLA4Ig, rAdV/Ins-CTLA4Ig)组,每组8只.采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测胰岛素、CTLA4Ig及其相关基因在小鼠肝组织的mRNA表达水平.应用简便血糖仪定期检测小鼠血糖水平.rAdV/Ins-CTLA4Ig组小鼠肝组织中CTLA4Ig mRNA的表达量显著高于rAdV/Ins组和空载腺病毒组(P＜0.01).rAdV/Ins CTLA4Ig组小鼠肝组织中IFN-γ mRNA的表达显著低于空载腺病毒组(P=0.04).与注射空载腺病毒组相比较,rAdV/Ins-CTLA4Ig和rAdV/Ins两组小鼠的血糖水平显著降低(均P＜0.05),且rAdV/Ins-CTLA4Ig组小鼠较rAdV/Ins组小鼠能维持更长的正常血糖时间(P＜0.01).胰岛素和CTLA4Ig共表达基因的重组腺病毒能转染小鼠肝脏,CTLA4Ig能在肝内成功表达并通过抑制炎症反应延长了胰岛素基因表达时间.
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CTLA4Ig融合蛋白体外免疫抑制作用机制探讨
本文在建立EAE Wistar大鼠模型的基础上,借助MBP特异反应的T细胞,体外探讨CTLA4Ig免疫抑制作用.实验结果发现,CTLA4Ig(10 μg/ml)可完全抑制MBP反应的大鼠T细胞增殖,而外源性IL-2的同时加入可恢复T细胞针对MBP的增殖反应.FACS检测经CTLA4Ig处理的T细胞表面仍有少量IL-2R的表达,且CTLA4Ig能诱导T细胞凋亡.RT-PCR结果显示CTLA4Ig能明显抑制IL-2 mRNA的表达,轻度抑制IFN-γ mRNA和TNF-α mRNA的表达,而对IL-10 mRNA的表达无明显影响.本研究旨在为CTLA4Ig进一步实验室及临床应用提供依据.
关键词： CTLA4Ig 实验性自身免疫性脑脊髓炎 髓鞘碱性蛋白 免疫抑制 -
银屑病的动态发病模式
本文阐述CC4+T细胞、抗原提呈细胞、CD8+T细胞三类细胞相继作用而形成的银屑病动态发病模式,强调了B7/CD28非抗原依赖共刺激信号在CD8+T细胞活化、银屑病发病中的重要作用,并提出通过CTLA4Ig阻断共刺激信号而抑制CD8+T细胞活化,为治疗银屑病提供了新的思路.
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大鼠移植肠局部CTLA4Ig基因转染的可行性研究
目的:探讨CTLA4Ig基因能否在移植小肠局部转染表达.方法:移植前经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的CT-LA4Ig cDNA重组质粒,应用免疫组织学及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)观察移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达.结果:免疫组织学及RT-PCR结果显示在移植后48 h移植小肠中有大量CTLA4Ig转基因产物的表达.结论:经肠系膜上动脉体外灌注脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA重组质粒可有效转染移植小肠.
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腺相关病毒载体介导的CTLA4Ig表达对大鼠肝移植免疫抑制作用的实验研究
目的:将CTLA4Ig腺相关病毒载体经门静脉导入移植肝中,研究该基因在移植肝中的表达以及对同种异体大鼠肝移植排斥反应的抑制作用.方法:二袖套法建立大鼠肝移植模型,供体为SD大鼠,受体为Wistar大鼠,受体随机分成3组,每组12对,对照组:将1011v.g.pSNAV-LacZ病毒液灌注移植肝门静脉并冷保存1 h;CsA组:移植后第1～7天腹腔内注射CsA 8 mg(kg·d);基因转染组:供肝加用1011v.g.pSNAV-CTLA4Ig病毒液灌注移植肝门静脉并冷保存1 h,术后1周剖腹取肝、脾和血标本.RT-PCR检测移植肝中CTLA4Ig的表达,双抗体夹心法测定血中CTLA4Ig浓度,TUNEL法检测肝细胞、脾淋巴细胞凋亡情况,并观察大鼠生存时间.结果:基因转染组大鼠生存时间平均为61天,与对照组10天比较差异有显著性(P＜0.05).基因转染组大鼠的肝脏中能扩增出特异性约500bp条带,而对照组未能扩增出相应条带,基因转染组血中CTLA4Ig浓度为(41.87±11.02)μg/ml,明显高于对照组(0.49±0.16)μg/ml,基因转染组大鼠肝移植术后1周肝细胞凋亡计数(5.88±1.88)%与对照组(28.25±6.50)%相比较差异有显著性(P＜0.05).基因转染组大鼠肝移植术后1周脾淋巴细胞凋亡计数(57.62±10.83)%与对照组(16.37±3.11)%相比较差异有显著性(P＜0.05).结论:经门静脉供肝灌注pSNAV-CTLA4Ig能在大鼠移植肝内良好表达,延长生存时间.
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新型免疫抑制剂——CTLA4Ig
近几十年以来，随着器官移植学科的迅速发展，对移植术后排斥反应的预防和治疗方面的研究日益加深，先后出现了合成药物、微生物制剂、生物制品以及中草药等免疫抑制药物，并取得了很好的临床疗效。国内外大量研究资料表明，细胞毒性T细胞相关抗原（CTLA-4）的胞外段与人IgG恒定区重组的融合蛋白CTLA4Ig是阻断B7-CD28协同刺激途径的有效制剂，具有诱导抗原特异性免疫耐受作用［1］，可作为一种有潜在治疗价值的移植免疫抑制剂。下面就近年来国外关于CTLA4Ig的相关研究进展作一综述。
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重组人CTLA4Ig融合蛋白体外对人T淋巴细胞功能的影响
目的研究重组人CTIA4Ig对人T淋巴细胞功能的影响.方法采用初次混合淋巴细胞培养、再次混合淋巴细胞培养及细胞毒实验的方法.结果 CTLA4Ig在浓度高于3 mgL-1时能有效地抑制初次混合淋巴细胞反应(P<0.05),其在作用24 h内不能发挥有效的抑制作用,72 h能达大抑制效率;在再次混合淋巴细胞反应实验中CTLA4Ig作用后的T淋巴细胞对同一供者的外周血单核细胞的刺激表现出特异性无反应,而对无关供者的外周血单核细胞的刺激能产生正常的应答反应.结论 CTLA4Ig在体外能抑制T细胞的增殖,并且能诱导T细胞产生抗原特异性无反应.
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导入CTLA4Ig基因对肝移植大鼠Fas mRNA表达的影响
目的:探讨导入CTLA4Ig基因对同种异体肝移植受体鼠Fas mRNA表达的影响,从分子水平上研究阻断共刺激通路引起免疫抑制作用的机制.方法:二袖套法建立大鼠肝移植模型,供体为 LEWIS大鼠,受体为BN大鼠.利用腺病毒作载体,将CTLA4Ig 基因导入同种异体肝移植的受体鼠内,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测 Fas mRNA 在受体鼠内的表达.结果:导入CTLA4Ig基因后的受体鼠 Fas mRNA 的表达要明显低于未导入该基因的受体鼠(P＜0.05 ).结论:导入CTLA4Ig基因能明显降低受体鼠Fas mRNA表达,减轻细胞凋亡,对同种异体移植排斥反应有明显抑制作用.
