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Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究
目的:采用高分辨率熔解曲线技术(HRM),应用ITS2序列对人参和西洋参药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段.方法:收集人参、西洋参以及购买人参商品粉末药材,提取DNA,选择ITS2作为鉴别序列.在HRM-PCR条件下,建立人参和西洋参的标准高分辨熔解曲线、熔解曲线模型并确定Tm值;应用该方法检测市场随机收集的10份人参商品.结果:通过比较分析,人参和西洋参能够很好的区分开,10份人参商品粉末的高分辨熔解曲线、熔解曲线的峰形和Tm值均与人参相吻合,初步说明这10份人参商品都含有人参.进而将其PCR产物测序,以验证该结果.结论:Bar-HRM方法可简单、快速、高通量化和可视化的实现人参商品粉末药材的快速检测.
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基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术,在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景.文章将高分辨率熔解曲线技术应用于鹿茸真伪鉴别,利用CO Ⅰ序列,在退火温度为60℃,45个循环数的条件下,建立正品鹿茸药材熔解曲线模型,并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度的适宜范围.结果表明,鹿茸药材在模板DNA质量浓度为10～100 mg·L-1、引物浓度0.2 μmol·L-1,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1的条件下,梅花鹿熔解曲线为双峰,其Tm分别为(81.96±0.07),(84.51±0.03)℃;马鹿熔解曲线为双峰,其Tm为(82.58 ±0.13),(85.95±0.05)℃.该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材真伪鉴定.
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高分辨熔解曲线基因分型技术检测尼古丁受体rs1051730和rs16969968单核苷酸多态性
目的 寻求费用低廉、简便、快速的方法检测广东地区汉族慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者尼古丁受体rs1051730和rs 16969968单核苷酸多态性.方法 收集2010年9月至2012年4月在广州医科大学附属市—人民医院、广州医科大学附属第一医院、广州医科大学附属第三医院住院及门诊受试者1 248例,从广州荔湾城区和韶关云岩、桂头农村流行病学调查的资料抽取533例,共计1 781例患者,分为COPD组1 013例,非COPD对照组768例.应用高分辨率熔解曲线(HRM)技术,对尼古丁受体基因rs1051730和rs16969968进行分型,并以焦磷酸测序法进行对照.Hardy-Weinberg定律检测rs1051730和rs16969968单核苷酸多态性(SNP)是否符合遗传平衡.结果 以HRM法能够较准确、快速区别出COPD与非COPD对照者尼古丁受体rs 16969968 A风险等位基因频率及基因型频率的差异,HRM分析显示rs 1051730分为3型,分别为CC、CT、TT型,rs 16969968也分为3型,分别为GG、AG、AA型,高分辨率熔解曲线可清楚的分辨rs 1051730基因型及rs 16969968基因型.rs 16969968风险等位基因A的基因频率在COPD患者中为4.3％,在对照组中为3.0％ (P=0.043).杂合基因型AG在COPD的基因型频率为8.6％,对照组为5.7％(P=0.025),突变型AA罕见(仅0.1％).rs1051730风险等位基因T和等位基因频率及基因型频率与rs 16969968完全相同,连锁性分析发现两位点完全相关.200例标本测序结果显示,199例HRM基因分型结果与测序相同,仅1例结果不同,与测序符合率达98％以上,两位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律(x2=0.178,P＞0.05).结论 HRM费用低廉、简便、快速,能准确对尼古受体rs1051730和rs 16969968基因分型.
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应用高分辨熔解曲线分析法检测遗传性球形红细胞增多症患者SLC4A1基因突变
目的:探讨高分辨熔解(HRM)曲线分析法检测遗传性球形红细胞增多症(HS)患者SLC4A1基因D38A和K56E突变位点的可行性及其意义.方法:抽取23例HS患者外周血样本进行常规检测,提取基因组DNA,针对SLC4A1基因突变位点D38A和K56E设计引物,应用HRM法对所有样本进行突变分析,并通过DNA测序技术对HRM结果进行验证.结果:23例HS患者中,HRM法共检测出杂合突变型基因6例,其中包括D38A突变3例,K56E突变3例.DNA测序结果与HRM法检测结果一致.结论:应用HRM法能准确检测SLC4A1基因D38A和K56E突变位点,具有高效、快速、可靠等优点,不仅可用于临床辅助诊断,还有望成为确定HS患者基因突变谱的新方法.
关键词： 遗传性球形红细胞增多症 高分辨熔解曲线 带3蛋白 SLC4A1基因 -
基于HRM的小扩增子法研究ABCA1基因变异与良性前列腺增生及前列腺癌的关联
目的：基于 HRM 的小扩增子法（small－amplicon），探索胆固醇相关转运蛋白 ABCA1基因变异 rs2230806， rs2066882与良性前列腺增生（ BPH）及前列腺癌（ PCA）之间的关联。方法基于高分辨熔解曲线（ HRM）技术，建立变异位点的小扩增子分型方法，通过Idaho LightScanner分析，对391例BPH患者，222例PCA患者和86例正常对照者的DNA样本进行分型应用。结果所建立的HRM技术成功对两个SNP位点进行基因分型，不受限于基因变异的位置特征，可成功区分三个变异位点的不同突变型和野生型，并且达到较高的重复性和准确性，经Sanger法测序验证结果完全一致。风险等位基因rs2066882－A的携带可增加BPH（P＜0．001， OR＝3．871）及PCA（P＜0．001， OR＝3．708）的风险；rs2230806在各组间的分布未见统计学差异。结论基于小扩增子法的HRM分型技术，可成功对ABCA1基因变异rs2230806，rs2066882进行分型，风险等位基因rs2066882－A的携带可增加BPH和PCA的风险。
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应用Taq Man探针法与高分辨熔解曲线法检测HLA-B27基因诊断强直性脊柱炎的价值
目的 运用Taq Man探针法与高分辨熔解曲线法检测疑似强直性脊柱炎患者的人类白细胞抗原HLA-B27,并探讨其方法的有效性和应用价值.方法 分别将疑似强直性脊柱炎患者的血样DNA进行HLA-B27的Taq Man探针法和高分辨熔解曲线法检测,并以DNA直接测序法所得阳性结果作为金标准,来确定Taq Man探针法和高分辨熔解曲线法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值.结果 55例样本中,Taq Man探针法和高分辨熔解曲线法与DNA测序法的符合率分别为98.2％和92.7％.Taq Man探针法检测HLA-B27的敏感度为0.970,特异度为1.000,阳性预测值为1.000,阴性预测值为0.956；高分辨熔解曲线法检测HLA-B27的敏感度为0.879,特异度为1.000,阳性预测值为1.000,阴性预测值为0.846.结论 Taq Man探针法与高分辨熔解曲线法均具有准确性好、灵敏度高、检测快速等优点,适合于临床HLA-B27的检测.
关键词： HLA-B27 基因 Taq Man探针法 高分辨熔解曲线 强直性脊柱炎 -
运用HRM技术分析7个SNP位点与2型糖尿病相关性
目的 采用高分辨熔解曲线(high-resolution melting,HRM)方法检测7个2型糖尿病(T2DM)患者相关易感单核苷酸多态性,并分析该多态性与2型糖尿病的相关性.方法 选取202名T2DM患者和200名健康志愿者,提取外周血DNA,采用HRM技术分析其多态性,并用测序法证实.结果 成功地检测T2DM患者相关易感单核苷酸多态性.HRM技术检测能准确区分各种基因型,其结果与测序法一致;研究还显示rs10811661和rs10923931位点在本研究人群中与T2DM无相关,此外rs7961581位点OR值<1,提示其在中国汉族人群,对于T2DM可能起保护作用;本研究中的rs8050136,rs10811661,rs7578597,rs864745均OR值>1,可能是疾病风险因素.结论 成功地建立了采用HRM的简单、快速和精确地分析T2DM患者相关易感单核苷酸多态性的方法;推测这些易感单核苷酸多态性可能与2型糖尿病发病相关.
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常见单核苷酸多态性分析方法的原理和应用简析
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而形成的DNA序列多态性.作为第3代遗传诊断标记,在遗传学诊断、药物基因组学、疾病易感性研究、生物学的进化以及遗传育种等领域有着广泛的应用.因而针对SNP的研究越来越多,相应的筛查方法也越来越多.该文就SNP各种筛查方法的原理和应用价值等方面进行归纳和总结.
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基于高分辨熔解曲线技术的ZNF217基因多态性研究在胰腺癌诊断中的价值
目的 验证高分辨熔解曲线技术(HRM)在基因分型中的应用,探讨锌指蛋白217(ZNF217)基因变异(rs2766669、rs35720349、rs1056948)与胰腺癌之间的关系.方法 收集120例胰腺癌患者和132例正常对照者的血液样本,对2组DNA样本的rs2766669、rs35720349、rs1056948 SNP位点进行基因分型.结果 HRM技术成功对3个SNP位点进行基因分型,并达到较高的准确性和重复性,经Sanger测序验证结果完全一致.风险等位基因rs2766669-G和rs35720349-A在2组间的分布差异有统计学意义(P＜0.05),rs1056948各基因型在2组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HRM分型技术可对ZNF217基因变异多态性位点rs2766669、rs35720349、rs1056948进行分型,rs2766669、rs35720349基因位点变异能增加胰腺癌的发病风险,锌指蛋白217基因变异可能与胰腺癌易感性有关.
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一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法——高分辨率熔解曲线分析法
目的 建立利用高分辨率熔解曲线(HRM)分析快速鉴定CLN6(神经元蜡样脂褐质沉积症,ceroid-lipofuscinosis,neuronal 6)小鼠(Cln6基因移码突变)基因型的方法.方法 根据NCBI公布的小鼠cln6序列(NC 00075)设计HRM引物和测序引物,然后采用HRM技术获得高分辨熔解曲线鉴定实验小鼠基因型,同时通过直接测序法进行验证,评价其灵敏性和准确性.结果 181只实验小鼠经HRM检测,共有野生型11只、Cln6基因突变杂合子73只和纯合子97只,HRM结果和直接测序结果完全一致,准确性为100 %.结论 HRM方法检测DNA微小突变时具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染以及准确度高等优点,值得推广.
关键词： 高分辨熔解曲线 神经元蜡样脂褐质沉积症 Cln6模型小鼠 -
赤道几内亚比奥科岛G6PD缺乏症分子流行病学研究
目的 探讨非州西部赤道几内亚比奥科岛(Bioko Island)人群的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发生率及基因型. 方法 在2012年1月至5月期间,用荧光斑点法对2 187名比奥科岛当地居民进行G6PD缺乏症筛查.采用高分辨熔解曲线(High-resolution melting,HRM)分析G6PD缺乏的标本的c.202 G＞A与c.376 A＞G.对HRM筛选不出突变的G6PD酶学缺乏的样本,针对非洲的其他突变类型:c.542 A＞T(rs5030872)、c.680 G＞A(rs137852328)、c.968 T＞C(rs76723693)进行PCR-DNA测序. 结果 赤道几内亚比奥科岛人群的G6PD缺乏症总发生率为8.64％ (189/2 187),其中男性84例(9.04％,84/929),女性105例(8.34％,105/1 258),男女检出率比为1.08:1.在189例G6PD缺乏标本中共检出两种基因类型,其中包括G6PD A变异体(c.376 A＞G/c.202 G＞A)186例(98.41％,186/189G6PD Betica(c.376 A＞G/c.968T＞ C)3例(1.59％3/189). 结论 赤道几内亚比奥科岛是G6PD缺乏症高发区,基因型比较单一.HRM技术可用于非洲地区G6PD缺乏症的临床诊断和流行病学研究.
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高分辨熔解曲线检测潮汕汉族人群的载脂蛋白E基因多态性
目的 研究载脂蛋白E (Apo E)基因单核苷酸多态性各等位基因及基因型在潮汕汉族人群中的分布频率,比较其在不同种族间分布的差异. 方法 采用高分辨熔解曲线分型技术检测100例潮汕地区汉族人群的Apo E基因rs429358和rs7412多态性.PCR-测序法作为金标准进行比对. 结果 在潮汕地区汉族人群中存在Apo E基因rs429358和rs7412多态性.潮汕人的Apo E基因型分布以E3/E3常见,其次为E4/E3.与非洲及欧洲人群比较,Apo E基因多态性的分布频率均存在显著性差异(P＜0.05);而与中国汉人比较差异无显著性(P＞0.05). 结论 采用高分辨熔解曲线法进行Apo E基因多态性检测,其操作简便省时,不易交叉污染;获得的各种基因类型特征性强,适用于临床快速诊断分型和遗传学人群研究.Apo E的3种常见等位基因频率分布存在地域差异.
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PCR-HRM技术在微生物鉴定中的应用
目前,在微生物检验中,分子生物学技术的应用逐渐增多[1-6],高分辨熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术就是其中的一种[7],其分析原理是在标准PCR试剂的基础上再加入可与双链DNA结合的饱和性荧光染料,扩增结束后即开始运行HRM程序,将PCR产物自低到高(60～95 ℃)逐步升温,每次升温0.02～0.1 ℃,此过程双链DNA解链,荧光染料脱落,不再产生荧光信号.以温度为横坐标,荧光强度变化率为纵坐标作图,即可得出对应于特定双链DNA的特征曲线.本文从以下两种策略就HRM在微生物鉴定、分型及细菌的耐药性基因分析等方面的研究进展综述如下.
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高分辨熔解曲线分析技术检测ALDH2和ADH1B基因多态性
目的 建立高分辨率熔解曲线分析体系检测乙醛脱氢酶-2(ALDH2)和乙醇脱氢酶-1B (ADH1B)基因多态性.方法 针对ALDH2和ADH1B基因序列设计短片段引物,在核酸扩增后,使用Eva Green染料分析不同聚合酶链反应(PCR)产物,并与Sanger测序法相比较.结果 采用高分辨熔解曲线(HRM )法在同一程序下,90 min内即可成功检测出ALDH2 rs671和ADH1B rs1229984各种基因型,且其结果与Sanger测序一致.结论 采用HRM 法检测ALDH2和ADH1B基因多态性快速简单、经济有效,值得推广.
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广东潮州地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变分析
目的:了解潮州地区新生儿的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,G6PD)缺乏症的发病率及基因突变特点.方法:采用荧光斑点法对2010至2012年潮州市中心医院出生的2 500例新生儿进行G6PD缺乏筛查.对初筛阳性的67例标本用高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting,HRM)和PCR-DNA测序法进行基因分型.结果:本次筛查发现潮州地区新生儿人群的G6PD缺乏症总发生率为2.6％(67/2 500),其中男婴44例(3.22％,44/1 365),女婴23例(2.03％,23/1 135),男女检出率比为1.91∶1 (44/23),两者之间无统计学差异(x2=3.404,P=0.065).67例初筛阳性标本中58例检测出有突变,9例未检出突变,共检出7种基因突变,含26例1 376 G＞T(c.1466G＞T,44.83％),22例1 388 G＞A(c.1478G＞A,37.94％),5例95 A＞G(c.185A＞G,8.62％),2例871 G＞A(c.961G＞A,3.45％),1例392 G＞T(c.482G＞T,1.72％),1例493 A＞G(c.583A＞G,1.72％),1例1360 C＞T(c.1450C＞T,1.72％),没有检出复合突变类型.结论:潮州地区具有较高的G6PD发生率.G6PD Canton(1376 G＞T)、G6PD Kaiping(1388 G＞A)和G6PD Gaohe(95 A＞G)3种突变类型常见.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症 新生儿筛查 基因突变 高分辨熔解曲线 DNA测序 -
整合高分辨熔解曲线和Sanger测序的MTHFR基因C677T多态性检测新方法及其应用
目的 建立一种基于整合优化的高分辨熔解曲线(HRM)和Sanger测序的分子诊断新方法,并探索其亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性(rs1801133)检测应用.方法 针对MTHFR基因C677T设计一对带有M13接头的通用引物,通过优化HRM反应体系,提高HRM的分析性能;并利用M13接头作为测序引物直接对HRM产物进行Sanger测序验证.收集该院体检中心的外周血标本1 030份,应用所建立的新方法检测标本MTHFR基因C677T多态性.结果 成功建立了基于整合优化的HRM和Sanger测序的新方法,并成功应用于临床标本MTHFR基因C677T多态性检测.1 030份标本中,CC基因型占39.13％,CT基因型占48.16％,TT基因型占12.71％.结论 本研究成功建立了一种检测MTHFR基因C677T的新方法,该方法具有简便经济、快速准确和高通量的特点,适用于临床大规模检测.
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两个原发性限局性皮肤淀粉样变家系的致病突变鉴定
目的 对两个中国人原发性限局性皮肤淀粉样变家系进行致病基因的突变鉴定.方法 在取得知情同意后,采集家系成员的外周血,使用酚-氯仿法提取基因组DNA;应用PCR扩增两家系先证者OSMR基因的全部17个外显子及外显子/内含子衔接区,通过Sanger测序鉴定候选致病突变;通过PCR-限制性片段长度多态性分析以及高分辨熔解曲线分析进行致病突变的家系验证.结果 家系1中6例患者均携带OSMR基因第10外显子c.1538G＞A错义突变,家系2中4例患者均携带OSMR基因第14外显子c.2081C＞T错义突变;两个家系中所有正常个体及健康对照均未携带上述突变.结论 在两个原发性限局性皮肤淀粉样变家系中发现了OSMR基因内的两个错义突变(c.1538G＞A和c.2081C＞T).该结果与既往的报道一致,再次证明了这些突变的致病性.
关键词： 原发性限局性皮肤淀粉样变 OSMR基因 突变鉴定 高分辨熔解曲线
