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胡椒碱抑制Ang Ⅱ诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖和迁移
目的 探究胡椒碱对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖和迁移的影响.方法 用改良组织块和胰蛋白酶消化联合培养原代细胞ASMCs.MTT检测Ang Ⅱ及其受体拮抗剂losartan对细胞增殖活性的影响.Ang Ⅱ和不同浓度胡椒碱作用ASMCs后,MTT、流式细胞术和Transwell分别检测细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移;ERK1/2抑制剂PD98059和losartan干预后,Western blot检测cyclin D1、MMP-9、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin等蛋白表达.结果 Ang Ⅱ(10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L)作用24 h后,可浓度依赖性地促进ASMCs增殖(P<0.05),其中10-7 mol/L Ang Ⅱ促进效果为显著;losartan处理则抑制Ang Ⅱ诱导的ASMCs增殖(P<0.05).10-7 mol/L Ang Ⅱ处理组ASMCs增殖活性、S期细胞分布比例、细胞迁移数目和蛋白质(cyclin D1、MMP-9和p-ERK1/2)表达均明显增加(P<0.05);而胡椒碱(10、25、50和100 μmol/L)处理可浓度依赖性地减轻Ang Ⅱ诱导的上述效应.并且,PD98059和losartan亦能阻断Ang Ⅱ对ASMCs p-ERK1/2、cyclin D1和MMP-9的上调作用.结论 胡椒碱能通过ERK1/2通路抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠ASMCs增殖和迁移.
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尼古丁受体对尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响
目的 探讨尼古丁受体在尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞(RASMCs)增殖中的作用.方法 分别设计相应的RNA引物,应用RT-PCR实验,观察RASMCs上存在的尼古丁受体(nAchRs)亚单位情况;应用细胞计数法检测尼古丁受体非特异性拮抗剂MCA和α7尼古丁受体特异性拮抗剂MG624对尼古丁作用的RASMCs增殖作用的影响;EDU掺入法测定应用尼古丁受体拮抗剂MCA和MG624对尼古丁作用的RASMCs DNA复制活性的影响.结果 RT-PCR实验证实大鼠气道平滑肌细胞上存在nAchRs亚单位,分别是α1、4、7、9、10,β1、2、4.细胞计数法检测发现尼古丁受体拮抗剂MCA、MG624均可以抑制尼古丁的促增殖作用,细胞数量明显下降,与尼古丁单独作用组比较差异有统计学意义(P＜0.05);EDU检测显示尼古丁受体拮抗剂MCA和MG624均可以抑制尼古丁的作用,使DNA复制活性降低,细胞复制水平下降,与尼古丁单独作用组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 尼古丁能够通过尼古丁受体介导促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖.
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AKT 信号转导途径在尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用
目的：探讨AKT信号途径在尼古丁诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖中发挥的作用。方法（1） Western blot检测不同浓度尼古丁作用原代培养的大鼠气道平滑肌细胞不同时间段，AKT／磷酸化AKT、GSK3β／磷酸化GSK3β在气道平滑肌细胞上的表达水平；（2）细胞分析计数仪检测AKT抑制剂和GSK3β抑制剂对尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞增殖活性的影响。实验分组：对照组、尼古丁单独作用组、AKT抑制剂LY294002组、AKT抑制剂LY294002＋尼古丁组、GSK3β抑制剂SB216763组、GSK3β抑制剂SB216763＋尼古丁组；（3） EDU摻入法测定AKT抑制剂和GSK3β抑制剂对尼古丁处理大鼠气道平滑肌细胞DNA复制活性的影响，实验分组同上。对照组应用1％胎牛血清培养基，各抑制剂和尼古丁应用1％胎牛血清培养基配制，分别在尼古丁加入前30 min应用。结果（1）大鼠气道平滑肌细胞上有AKT和GSK3β的表达；尼古丁引起AKT和GSK3β的快速磷酸化，且尼古丁促进AKT和GSK3β的磷酸化作用具有时间依赖性；（2）细胞计数法显示，AKT抑制剂与尼古丁联合组细胞计数明显低于尼古丁单独作用组，差异有统计学意义（P＜0．05）；（3）EDU摻入法测定显示，AKT抑制剂与尼古丁联合组细胞DNA复制水平明显下降，与尼古丁单独作用组相比，差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖作用依赖AKT／GSK3β信号途径。
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尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用
目的：探讨尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用。方法（1）不同浓度的尼古丁作用大鼠气道平滑肌细胞24、48 h，应用细胞计数法检测大鼠气道平滑肌细胞的增殖变化；（2）不同浓度的尼古丁作用大鼠气道平滑肌细胞24 h，应用流式细胞术检测细胞周期变化；（3）1×10-5 mol／L尼古丁分别作用大鼠气道平滑肌细胞12、16、20、24 h，Western blot检测Cyclin D1的表达水平。结果（1）尼古丁组细胞计数均明显高于对照组，且尼古丁的促增殖作用与浓度和作用时间具有相关性。1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 mol／L尼古丁作用24 h，以对照组细胞计数值为1，则尼古丁组细胞计数分别为1.38、1.41、1.27、1.30，差异均有统计学意义（ P＜0.05）；尼古丁作用48 h，尼古丁组细胞计数分别为1.53、1.54、1.32、1.37，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）各浓度尼古丁组S期的细胞分数均比对照组明显升高，差异有统计学意义（ P＜0.05）。以对照组S期的细胞分数值为1，1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol／L尼古丁作用24 h，尼古丁组S期的细胞分数分别为1.53、2.35、3.83、2.86，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）1×10-5mol／L尼古丁作用细胞12、16、20、24 h后，在12、20 h大鼠气道平滑肌细胞的Cyclin D1表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（ P＜0.05）。结论尼古丁能够通过上调Cyclin D1促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖。
