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量子点540诱导人皮肤成纤维细胞DNA双链断裂
目的 探讨具有多聚乙烯基乙二醇(PEG)作为包被材料及无PEG包被的CdSe/ZnS(内芯/外壳)量子点540的DNA损伤特性.方法 分别应用细胞毒性实验(MTS)和苔盼蓝法分析经量子点540处理后人皮肤成纤维细胞的存活率和增殖情况,γH2AX焦点形成及彗星实验探讨DNA损伤情况.结果 8nmol/L和80nmol/L有PEG包被的量子点540处理细胞后,细胞生存率及生长趋势与阴性对照相比差异无统计学意义.而无PEG包被的量子点540在同样剂量下可引起细胞生存率及生长趋势的下降.同时,无PEG包被的量子点540可使细胞核内γH2AX焦点数量以及有γH2AX焦点的细胞数量增加,有彗尾的细胞数量增加,且尾相增大.结论 量子点540在PEG的包被下无明显细胞毒性.在没有PEG包被的情况下,量子点540均表现出细胞毒性以及遗传毒性作用,可导致细胞DNA的双链断裂.
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γH2AX的检测方法简介
DNA损伤有许多不同的形式,如碱基修饰,DNA单链断裂(DNA single stranded breaks,SSBs),DNA链内和链间交联以及DNA双链断裂(DNA double stranded breaks,DSBs)等,其中DSBs被认为是DNA严重的损伤.
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γH2AX和ATM与内源性氧化剂所致DNA损伤关系的研究进展
本文综述了正常细胞及肿瘤细胞系中内源性氧化剂所致的磷酸化ATM(CAA)和γH2AX(CHP)的形成与表达;同时综述了各种影响因子和生长条件对CAA和CHP表达的影响.
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γH2AX在HPV16阳性宫颈鳞癌组织中的表达及意义
目的 探讨γH2AX在HPV16阳性宫颈鳞癌组织中的表达及意义.方法 对74例宫颈鳞癌组织通过DNA提取,PCR检测,分析HPV的感染情况并筛选HPV16阳性宫颈癌组织;进而对HPV16阳性的宫颈癌石蜡组织连续切片HE染色明确组织型别,进行HPV16 DNA原位杂交检测HPV定位、免疫组化检测γH2 AX和p16蛋白的表达;后选取30例典型的包括从正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变到宫颈原位癌渐变的组织切片,对比HPV DNA定位与γH2 AX和p16蛋白的表达,分析γH2 AX作为HPV感染导致宫颈癌发生过程中生物标记物的可行性.结果 经PCR扩增证明HPV感染率为98.65％,HPV16是常见的型别占74.32％;原位杂交结果显示正常宫颈组织和CIN Ⅰ检测不到HPV16 DNA的存在,CINⅡ中HPV主要为游离型存在,随着宫颈病变的加重,HPV16 DNA逐渐出现整合形式;p16和γH2AX的表达均随着宫颈上皮病变级别的增加其阳性表达率增高,HPVDNA和γH2AX的表达均以颗粒细胞层和棘细胞层为主,定位具有一致性,HPV DNA和p16的表达定位不具有一致性.结论 γH2AX作为DNA损伤激活的重要蛋白,可作为HPV16感染致宫颈癌发生过程中的生物标记物.
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慢性炎症损伤在二乙基亚硝胺诱导大鼠肝细胞癌发生中的作用
目的 探讨慢性炎症损伤在二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝细胞癌(肝癌)发生中的作用.方法 健康雄性Wistar大鼠40只,按随机数字表法随机分为亚硝胺组(32只)及对照组(8只).亚硝胺组腹腔注射DEN 60 mg/kg,1次/周,连续8周;对照组不给药.亚硝胺组于第4、8、12、16周随机取8只大鼠的肝组织行病理学切片,预留门静脉血,第16周处死所有大鼠.HE染色观察肝组织炎症损伤情况,免疫组化法检测肝组织DNA修复蛋白 γH2AX的表达,ELISA检测血清炎症因子IL-6、VEGF、TNF-α 的表达水平.3组血清炎症因子比较采用单因素方差分析和LSD-t检验.两组γH2AX阳性率比较采用单样本t检验或独立样本t检验.结果 亚硝胺组大鼠第4、8、12、16周肝组织病理炎症损伤逐渐加重,并终发展为肝癌;对照组未见异常.亚硝胺组大鼠第4、8、12、16周肝组织 γH2AX阳性率分别为(0.3±0.1)%、(3.1±0.6)%、(7.8±2.8)%、(11.4±2.3)%,明显高于对照组的0(Z=2.34,2.84,4.11,5.31;P<0.05).亚硝胺组第4、8、12、16周血清IL-6水平分别为(104±7)、(117±10)、(168±16)、(181±11)ng/L,明显高于对照组的(83±53)ng/L(LSD-t=5.19,8.41,21.03,24.25;P<0.05).亚硝胺组第4、8、12、16周血清VEGF水平分别为(257±16)、(302±21)、(387±36)、(439±26)ng/L,明显高于对照组的(164±15)ng/L(LSD-t=10.17,15.04,24.39,29.18;P<0.05).亚硝胺组第4、8、12、16周血清TNF-α水平分别为(108±5)、(125±11)、(156±17)、(181±14)ng/L,明显高于对照组的(79±6)ng/L(LSD-t=7.30,11.59,19.39,25.70;P<0.05).结论 肝脏慢性炎症损伤在DEN诱导大鼠肝癌的发生中起重要作用,此过程伴随着高水平的炎症因子和持续的DNA损伤.
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人骨肉瘤细胞DNA双链断裂修复γH2AX分析
目的:探讨人骨肉瘤细胞U2OS中利用γH2AX分析评价细胞DNA双链断裂(DNA Double-Strand Breaks,DS-Bs)损伤反应动力学过程.方法:用免疫荧光和蛋白质印迹法结合DNA损伤应答通路抑制剂及siRNA基因沉默技术分析U2OS细胞在遭受DSBs损伤处理前后γH2AX foci和其表达水平的动力学变化,并通过流式细胞术定量分析γH2AX的变化情况.结果:在细胞未经损伤处理时,U2OS细胞仅有极少量的γH2AX foci,而在遭受电离辐射(ionizingradiation,IR)后,γH2AX在损伤部位的募集和表达水平快速升高,1h内达峰值,该过程可被ATM抑制剂和磷酸肌醇激酶3相关激酶抑制剂Wortmannin抑制;而后随着时间的推移,γH2AX表达又逐渐消退,反映了细胞DSBs损伤应答的动力学过程.利用小分子RNA敲除参与DSBs损伤修复的关键因子Mre11表达的细胞及对照siRNA转染细胞,IR处理4h后γH2AXfoci数分别为31.68±4.59和21.33±2.08,处理8h分别为21.85±2.49和12.02±4.13,处理12h分别为19.65±2.34和8.51±2.17),处理16 h分别为18.05±1.75和6.94±3.19,各时间点Mre11沉默组细胞的γH2AXfoci数显著多于对照siRNA处理组细胞,P=0.013,反映了延长的DSBs损伤修复动力学(减缓的γH2AXfoci消退).经γH2AX和PI双染色流式细胞术发现,不同细胞分期γH2AX阳性率差异有统计学意义,G1期细胞在IR处理前为(1.34±0.28)％,处理后为(20.25±3.56)％,P＜0.001;S期细胞在IR处理前为(1.26±0.19)％,处理后为(79.48±5.72)％,P＜0.001;G2/M期细胞在IR处理前为(8.84±1.25)％处理后为(29.49±4.36)％,P＜0.001.结论:γH2AX分析可有效分析U2OS细胞的DSBs损伤应答反应动力学,U2OS细胞具有低γH2AX背景、易于传代培养等优点,可作为研究细胞DSBs损伤应答反应的模式细胞.
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RBBP6敲除小鼠胚胎致死原因的探讨
目的 探索成视网膜细胞瘤基因结合蛋白6(Rb binding protein 6,RBBP6) 基因敲除小鼠胚胎致死的原因.方法 敲低细胞内源性RBBP6后检测磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)的蛋白水平,利用免疫组化检测RBBP6-/-小鼠胚胎中γH2AX的蛋白水平,由此分析两者的相关性.结果 RBBP6敲低的细胞中γH2AX蛋白水平显著上调,RBBP6-/-小鼠胚胎中γH2AX的蛋白水平也明显上调.结论 RBBP6-/-小鼠胚胎中γH2AX蛋白水平显著升高,从而引发基因组的不稳定性,是RBBP6-/-小鼠胚胎致死的原因之一,并提示RBBP6可能参与DNA损伤应答.
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~(60)Co γ射线诱导EJ细胞DNA损伤及γH2AX表达的研究
目的 探讨不同剂量~(60)Co γ射线对EJ细胞DNA损伤的情况,不同剂量~(60)Co γ射线照射EJ细胞后诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成,以及与γH2AX表达量的关系.方法 单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂损伤情况.免疫荧光法检测不同剂量γ射线照射后立即、以及2 Gv γ射线照射后不同时间的EJ细胞中γH2AX焦点的数量.流式细胞分析法检测不同剂量γ射线照射后EJ细胞中γH2AX蛋白表达量的变化.结果 单细胞凝胶电泳结果显示,γ射线照射后DNA损伤情况明显加重,随照射剂量的增加,细胞尾矩不断加大,0 Gy组尾矩为0.24,4 Gy照射组尾矩为5.26;免疫荧光结果显示,随着照射剂量的增加,γH2AX焦点数目及大小均明显增加,照射的剂量范围从0.1-4 Gy均可检测,且照射剂量和焦点形成数目之间存在剂量.效应关系,0.1 Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达12.37个,4 Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达46个;2 Gy γ射线照射后24 h仍可检测到 γH2AX焦点,随时间延长焦点数目减少、强度减弱,具有时间依赖性.流式细胞检测结果表明,γ射线照射后 γH2AX蛋白表达量明显增加,呈现明显量效关系,0.1和4 Gy照射组γH2AX阳性细胞表达率分别为7.4%和29.2%.结论 免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目比其他实验方法更能敏感、直观的反映DNA损伤及修复情况,有望成为检测辐射损伤的理想生物指标.
关键词： ~(60)Coγ射线 照射 γH2AX DNA损伤 -
2-乙酰氨基芴诱导γH2AX焦点的形成
目的探讨DNA损伤剂2-乙酰氨基芴(2-AAF)是否可诱导γH2AX焦点的形成及γH2AX作为检测DNA损伤的一个新的特异指标的可能性.方法用2-AAF处理中国仓鼠CHL细胞,应用免疫荧光方法检测γH2AX焦点的形成,并通过中性彗星实验验证DNA损伤的程度.结果 0.1,1,5和20 mg·L-1的2-AAF 都可使细胞核内γH2AX 焦点数量及有γH2AX焦点生成的细胞数量增加,但只有20 mg·L-1 2-AAF处理的细胞才出现明显的彗尾增长及有彗尾的细胞数量增加.另外,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族抑制物渥曼青霉素可抑制2-AAF诱导的γH2AX焦点形成.结论 2-AAF可通过激活 PI3K家族成员使H2AX磷酸化,进而诱导γH2AX焦点的形成.γH2AX检测DNA损伤的敏感性优于彗星实验,因此,γH2AX有可能成为衡量DNA损伤程度的良好指标.
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γH2AX:DNA双链断裂的标志
γH2AX是目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一.细胞在电离辐射或其他因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂(DSBs),以及细胞自身调控的程序性DSBs和逆转录病毒转染细胞过程中产生的DSBs均可诱导H2AX的磷酸化(γH2AX)和簇集.本文对H2AX及其组蛋白家族,以及γH2AX与DSBs之间的关系及可能作为一个探测DNA损伤的新分子探针来利用作一简要综述.
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活性氧类物质对精子DNA的损伤及其检测
活性氧类物质(ROS)产生过多会破坏精子核内DNA的完整性,促进了一系列男性生殖功能的病理学改变.DNA损伤发生DNA断裂(DSBs)均可诱导H2AX的磷酸化(γH2AX)和簇集.近年来γH2AX识别抗体免疫荧光法是检测DNA双链断裂的热点之一.
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900MHz电磁辐射对大鼠睾丸组织氧化损伤和γH2AX蛋白表达的影响
目的 观察900 MHz电磁辐射对雄性大鼠睾丸组织氧化损伤和γH2AX蛋白表达的影响.方法 将健康6～8周龄清洁级SD雄性大鼠按体重随机分为正常对照组和辐射2、4h组,每组10只.采用900 MHz电磁辐射,每天1次,连续30d.测定大鼠睾丸组织MDA、GSH含量及SOD、GSH-Px活力以及γH2AX蛋白的表达.结果 与正常对照组比较,各辐射组大鼠睾丸组织MDA含量均增加,而SOD、GSH-Px活力和GSH含量均降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);且随着辐射时间的延长,大鼠睾丸组织MDA含量呈上升趋势,而SOD、GSH-Px活力和GSH含量均呈下降趋势.无论是免疫组化法还是Westem blot法,各辐射组大鼠睾丸组织γH2AX蛋白的表达水平均低于正常对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);且随着辐射时间的延长,大鼠睾丸组织γH2AX蛋白的表达水平呈下降趋势.结论 900 MHz电磁辐射可造成大鼠睾丸组织氧化损伤,抑制睾丸组织γH2AX蛋白表达.
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醋酸铅染毒致人外周血淋巴细胞遗传损伤的研究
目的 研究醋酸铅染毒致人外周血淋巴细胞遗传损伤情况.方法不 同浓度醋酸铅染毒人外周血淋巴细胞,CCK-8试验检测细胞活力;染色体畸变试验检测醋酸铅染毒对人外周血淋巴细胞染色体损伤作用;免疫荧光染色检测DNA双链断裂损伤生物标志物组蛋白H2AX的磷酸化(γ-H2AX)表达情况.结果 醋酸铅染毒抑制人外周血淋巴细胞活力,其24h的IC50值为168.5 μmol/L;醋酸铅染毒后,人外周血淋巴细胞染色体损伤程度和γ-H2AX焦点表达水平随醋酸铅浓度的增加和染毒时间的延长而升高,呈现明显的剂量效应和时间效应.结论 醋酸铅对人外周血淋巴细胞有潜在的细胞毒性和遗传毒性.
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应用γH2AX检测甲醛致DNA损伤的研究
目的 探讨磷酸化的H2AX(即γH2AX)能否灵敏、快速、简便的检测甲醛致DNA损伤.方法 用甲醛处理中国仓鼠肺细胞株(V79)肺细胞.应用免疫荧光实验检测γH2AX焦点的形成,并通过单细胞凝胶实验验证DNA损伤程度.结果 20μmol/L甲醛处理V79细胞10 min即可诱导γH2AX焦点形成增加,但2 h时才出现彗尾增长.1μmol/L甲醛处理细胞8 h时,γH2AX平均焦点数及焦点细胞率与对照组相比明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05),但此浓度在所有时间段都不能导致彗尾增长.结论 γH2AX可在早期监测甲醛对DNA的损伤,并能检测到低浓度的甲醛致DNA损伤,因此,其敏感性优于单细胞凝胶实验.
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γH2AX检测在DNA双链断裂研究中应用
DNA双链断裂(DSBs)是真核细胞DNA损伤严重的形式,DNA损伤反应的激活可以导致基因组的不稳定,从而引发肿瘤;H2AX磷酸化产生的γH2AX作为一种生物标志物可以清楚地反映DNA损伤程度和修复情况,被国内外广泛应用于细胞凋亡研究中,是细胞损伤应激反应的研究热点之一;本文对γH2AX用作DSBs检测的研究进展做一综述,对其在化合物的遗传毒性评估与临床肿瘤的早期筛查及治疗效果评价进行展望.
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UVB辐射对人角质形成细胞HaCaT的DNA损伤及其机制
目的 研究不同剂量UVB辐射对人角质形成细胞HaCaT DNA损伤的影响及机制.方法 采用紫外辐照装置照射入角质形成细胞HaCaT建立急性紫外辐射细胞模型;MTT法检测不同剂量紫外辐射对细胞存活的影响;免疫荧光和流式细胞术分别检测细胞核内磷酸化γH2AX焦点形成及蛋白表达水平;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测不同剂量不同时间照射后早期细胞凋亡百分数;免疫印迹法分别检测Caspase-3活化水平.结果 UVB辐射可抑制HaCaT细胞的存活,有一定的量效关系;相对较大剂量的UVB辐射可观察到明显的焦点形成;UVB照射后各剂量点磷酸化γH2AX的表达均明显高于未照射的对照组;UVB辐射可通过Caspase-3活化诱导细胞发生早期凋亡,照射后20 h,早期凋亡细胞百分数明显增加,特别是在UVB相对较大剂量范围内更明显,并有随照射剂量增高而增加的趋势.结论 UVB辐射可通过诱导DNA双链断裂抑制人HaCaT细胞存活,并通过激活Caspase-3而诱导细胞凋亡,细胞凋亡延迟,可能导致细胞更易于发生突变进而形成皮肤肿瘤.
关键词： UVB辐射 DNA损伤 γH2AX 人角质形成细胞HaCaT 皮肤癌 -
醋酸棉酚诱导人粘液表皮样癌MEC-1细胞DNA双链断裂
本文研究醋酸棉酚(gossypol acetic acid,GAA)对人粘液表皮样癌细胞MEC-1体外增殖的影响,并初步探讨其抑制肿瘤细胞增殖的机制.体外培养人粘液表皮样癌细胞系MEC-1细胞,用MTT法检测GAA对MEC-1细胞增殖的影响;用中性彗星实验检测GAA对MEC-1细胞的DNA双链断裂;用免疫荧光染色法检测GAA诱导的磷酸化组蛋白γH2AX焦点形成.结果显示,5～40 μmol/L的GAA以时间和浓度依赖方式抑制MEC-1细胞的生长;2.5～40 μmol/L的GAA作用24 h,或20 μmol/L的GAA作用3～48 h,CASP软件分析显示MEC-1彗星细胞的头部DNA百分含量减少,尾长、彗星长度、尾部DNA百分含量、尾矩和Olive尾矩增加;2.5～20 μmol/L的GAA作用24 h,或20 μmol/L的GAA作用3～48 h,γH2AX阳性细胞率随着浓度和时间的增加而增加.上述结果表明GAA抑制MEC-1细胞增殖,诱导DNA双链断裂是其抑制肿瘤细胞增殖的机制之一.
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DNA损伤与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病发病的主要病理基础.典型的AS病变表现为大、中动脉某些部位内膜局限性增厚,其中有大量脂质沉积、单核细胞和淋巴细胞浸润、血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)凋亡异常、中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)迁移至内膜并大量增生,同时伴有胶原、蛋白聚糖等多种细胞外基质积聚,逐渐形成深部富含脂质和坏死成分的脂核以及突出于血管腔面的VSMC纤维帽.随着病程的进展,斑块破裂导致血栓形成、伴有病灶破裂或溃疡形成、钙化等继发性改变.这些病变形成的分子机制十分复杂,虽有脂质浸润学说、炎症学说、单克隆学说等许多学说对其发生发展过程进行了解释,但迄今为止,仍有许多尚未认识的问题.Wallace等[1]于1991年首次提出,线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)损伤与冠心病有关.从那以后,越来越多的研究开始关注DNA损伤与AS之间的关系[2-3].
关键词： DNA损伤 动脉粥样硬化 氧化应激 γH2AX 共济失调毛细血管扩张突变蛋白 -
香烟烟雾诱导气道上皮细胞DNA损伤反应研究
目的 探讨香烟烟雾提取物(CSE)诱导人气道上皮(HBE)细胞DNA损伤反应.方法 HBE细胞经不同浓度CSE干预后,采用细胞克隆实验探究HBE细胞增殖能力变化,运用酶联免疫吸附实验(Elisa)检测炎症水平,免疫荧光法检测DNA损伤反应表达水平.结果 克隆形成实验发现HBE细胞增殖能力明显减弱,Elisa检测发现HBE细胞炎症反应随CSE浓度增加而增加,免疫荧光法显示DNA损伤标记物γH2AX表达上调,上述结果在一定范围内呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 CSE诱导HBE细胞DNA损伤反应,影响HBE细胞基因组稳定性,减弱其增殖活力,进而导致慢性气道炎症的持续进展.
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DNA损伤标志物γH2AX在氧诱导视网膜新生血管形成中的作用
背景 氧浓度变化诱导产生视网膜新生血管,并导致细胞DNA损伤反应.以往认为促血管生成因子过度表达是血管新生的原因,但DNA损伤是否与视网膜新生血管有关尚不清楚. 目的 探讨参与DNA损伤修复的磷酸化蛋白γH2AX与小鼠视网膜血管新生的关系. 方法 应用72只17日龄C57BL/6J小鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组,每组18只.视网膜铺片免疫荧光法对比观察视网膜新生血管形态学变化及γH2AX表达情况.将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)分为正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组.细胞处理后12h,采用免疫荧光法比较并分析各组γH2AX的表达情况,采用Western blot法定量检测各组γH2AX的表达. 结果 正常对照组、OIR模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组17日龄小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积比较,总体差异均有统计学意义(F=437.62、93.05,均P＜0.01),其中OIR模型组和OIR阴性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较正常对照组明显增大;OIR阳性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较OIR模型组和OIR阴性对照组明显减小,差异均有统计学意义(均P＜0.01).17日龄小鼠视网膜γH2AX焦点团聚集出现情况与新生血管和无灌注区面积大小变化趋势相一致.正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组HUVECs中γH2AX焦点阳性细胞百分数比较,差异有统计学意义(F=64.97,P＜0.01),其中低氧模型对照组和阴性干扰组γH2AX焦点阳性细胞百分数均较正常对照组明显增大,差异均有统计学意义(均P＜0.01);阳性干扰组均较低氧模型对照组和阴性干扰组明显减小,差异均有统计学意义(均P＜0.01).各组HUVECs间γH2AX的表达量与免疫荧光趋势相一致.结论 缺氧环境下,γH2AX在小鼠视网膜血管和体外培养的HUVECs中均大量表达.γH2AX的表达与视网膜血管新生有关.低氧诱导的DNA损伤修复反应可能与视网膜血管新生有一定关系.
关键词： 视网膜 新生血管 人脐静脉血管内皮细胞 γH2AX
