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hMTH1缺陷细胞株建立及生物学特性研究
目的建立hMTH1缺陷细胞株,观察该缺陷所引起的生物学效应.方法用hMTH1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-T)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),半定量RT-PCR鉴定其对hMTH1基因mRNA表达的抑制效果.同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,用流式细胞术观察细胞周期,软琼脂培养法鉴定恶性程度.结果 pEGFP-C1-T载体在转染细胞内可较稳定表达,缺陷细胞株hMTH1 mRNA表达水平比HLF细胞下降了47%.hMTH1缺陷细胞生长形态无明显变化,细胞倍增时间为0.89 d,与HLF细胞0.93 d接近,细胞周期各时相未受影响,软琼脂培养未见细胞集落.结论 hMTH1缺陷细胞株成功建立,该缺陷不足以单独引起可观察的生物学效应.
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HBx上调HepG2细胞DNA修复酶hMTH1表达的意义
目的: 探讨DNA氧化损伤修复酶hMTH1在HBx致肝细胞癌发生机制中的作用.方法: 应用HPLC/ECD法检测稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx及其对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞中的8-OHdG的含量;并以β-actin为内对照, 应用RT-实时PCR定量检测各组细胞中可水解8-OHdG的DNA修复酶hMTH1的表达.结果: 8-OHdG在He pG2/HBx细胞中的含量(fmol 8-OHdG/mg DNA)显著高于对照组HepG2和HepG2/pDNA3.1细胞(36.5±6.25 vs8.52±1.65, 9.12±2.69, 均P<0.05). DNA修复酶hMTH1在HepG2/HBx细胞中的表达较两对照组细胞明显增高(1.213±0.100 vs 0.087±0.026, 0.112±0.052 hMTH1/β-actin mRNA×100, 均P<0.05).结论: H B x 可能通过诱导氧化应激增加HepG2细胞内DNA氧化损伤产物8-OHdG的含量, 从而反应性上调DNA修复酶hMTH1的表达.
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DNA修复酶hMTH1在乙型肝炎病毒x基因致人肝细胞系L02细胞恶性转化中的意义
目的 通过转摹因细胞模型L02/HBx观察乙型肝炎病毒x基因(HBx)对DNA修复酶hMTH1转录表达的调控及其对人肝细胞系L02细胞生物学特性的影响.方法 传代培养稳定表达HBx的转基因细胞模型ID2/HBx及空白对照组ID2细胞和空载体对照组L02/pcDNA3.1细胞,倒置显微镜下观察各组细胞的形态学特征,以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、流式细胞术枪测各组细胞增殖、细胞周期和凋亡状况,并进行软琼脂克隆形成实验观察细胞的恶性转化能力.同时应用实时定量PCR测定各组细胞DNA修复酶hMTH1的表达水平.结果 镜下观察发现L02/HBx细胞与对照组ID2细胞相比形态发生明显改变.MTT法显示L02/HBx细胞生长速度比两对照组显著加快.流式细胞术结果表明,HBx可加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡.软琼脂克隆形成实验发现L02/HBx细胞的克隆形成率明显高于L02细胞和ID2/pcDNA3.1细胞(P<0.05).实时定量PCR检测发现hMTH1在L02/HBx细胞中的表达显著高于L02细胞和L02/pcDNA3.1细胞(P<0.05).结论 HBx可诱导L02细胞发生恶性转化,在此过程中DNA修复酶hMTH1可出现反应性的上调表达.
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DNA损伤修复基因hMTH1多态性与尘肺发病风险相关性研究
目的 探究hMTH 1基因型分布与尘肺发病风险的关系,为进一步阐明尘肺的发生发展以及防治尘肺提供新的线索.方法 采用病例对照的研究方法,分别收集尘肺组和对照组的个人相关资料,采集外周血样本并提取DNA,利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP),分析hMTH1基因内含子4中c.Val 83 Met位点的多态性.结果 hMTH1基因3种基因型(c.83 Val/Val、Val/Met、MetMet)在病例组和对照组中的频率分布差异无统计学意义(x2=0.92,P=0.38).并且基因型Val/V al和Val/Met+ Met/Met(即至少携带一个编码Met的等位基因)在尘肺组和对照组中的分布频率差异无统计学意义.结论 hMTH 1 Va l83 Met多态性与尘肺病的发病风险可能无关.
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熊去氧胆酸对大鼠肝癌发生的抑制作用及机制
目的 研究熊去氧胆酸(UDCA)对大鼠肝癌发生的抑制作用并探讨其机制.方法 利用二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝癌模型,75只雄性Wistar大鼠随机分为5组:正常对照组、UDCA对照组、DEN组、UDCA高和低剂量组.DEN组及UDCA高低剂量组均给予DEN腹腔注射(20 mg/kg),正常对照组及UDCA对照组给予等剂量的生理盐水腹腔注射.同时UDCA对照组及UDCA高低剂量组分别按30、30、15 mg/kg给予UDCA灌胃,正常对照组及DEN组给予等量生理盐水灌胃.观察大鼠肝质量、体质量及肝脏系数的变化；并检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及甲胎蛋白(AFP)的含量；采用实时定量RT-PCR检测不同组间DNA损伤修复基因hMTH1在大鼠肝脏中的表达.结果 与正常对照组相比,DEN组大鼠的体质量明显降低,肝质量和肝脏系数明显增加,ALT、AST及AFP的含量均明显升高(P＜0.05)；与DEN组相比,UDCA高低剂量组各项指标明显好转.实时定量RT-PCR显示,hMTH1在DEN组大鼠肝脏中的表达较正常对照组明显升高(P＜0.05)；UDCA高低剂量组大鼠肝脏中hMTH1的表达较DEN组明显降低(P＜0.05)；且hMTH1在UDCA高剂量组中的表达也较UDCA低剂量组明显降低(P＜0.05).UDCA对照组与正常对照组相比,各项指标无统计学差异.结论 UDCA对大鼠肝癌发生有抑制作用,并能够抑制DNA损伤修复基因hMTH1的表达,其效果和剂量呈正相关,提示UDCA对肝癌的抑制作用可能与抑制氧化应激有关.
