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MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞DLK1表达水平的影响
目的 DLK1-DIO3印记区间位于人14号染色体、小鼠12号染色体上,在两者的表达中高度保守,其间有三个父本控制的蛋白质编码区域,以及多个母本控制的非编码转录本,还有大量的C/D snoRNA和microRNA.其间有三个差异甲基化区,分别为父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR,以及母本甲基化的MEG8-DMR.先前关于对MEG8-DMR的研究集中于肿瘤方面的较少,因此探究差异甲基化区MEG8-DMR对肿瘤发生的影响以及其调控机制,深入分析印记基因参与肿瘤的发病机理,具有重要的意义.方法 本实验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,先依据脱靶位点少的原则选择sgRNA,构建重组载体并通过脂质体法将其转染入Huh7细胞后检测出重组载体在Huh7细胞系中对MEG8-DMR区域进行了有效的敲除.结果 敲除MEG8-DMR后细胞形态没有发现明显变化,同时发现敲除MEG8-DMR导致上游基因DLK1表达水平的下调.结论 本实验中通过对MEG8-DMR的敲除,导致DLK1表达下调,而DLK1在几种肿瘤包括神经纤维瘤、骨髓增生异常综合征和肝癌患者的血清中呈高表达,且肿瘤的形成是多因素、多基因共同参与的结果,MEG8-DMR上下游区域分布着一系列母系表达非编码转录本,和大量的miRNA和C/D snoRNA,因此,MEG8-DMR及临近基因在肝细胞性肝癌的发生过程中可能具有表达调控的重要功能.
关键词： MEG8-DMR 肝细胞性肝癌 CRISPR/Cas9 Huh7细胞 DLK1 -
B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的影响
目的 探讨B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞基因组表达模式的影响.方法 重组B或C基因型乙型肝炎病毒(pHY106-BHBV和pHY106-CHBV)转染Huh7细胞,以pHY106空载体为对照,48 h后进行芯片杂交,筛选出表达差异值Gy5/Cy3> 2或< 0.5的基因.pHY106-BHBV、pHY106-CHBV分别转染Huh7细胞48 h,以pHY106空载体为对照,应用real-time PCR对基因芯片差异表达的部分基因进行验证.结果 pHY106-BHBV转染Huh7细胞48 h后,从4097个基因中筛选出差异表达基因共60个;pHY106-CHBV转染Huh7细胞48 h后,筛选出差异表达基因共120个;real-time PCR证实pHY106-BHBV转染Huh7细胞48 h后,IFNGR2、GPR125、DDEF2和PI3K mRNA表达水平均出现不同程度下调,pHY106-CHBV转染Huh7细胞48 h后,EEF2和INF592表达下调,与基因芯片结果一致.结论 B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞表达谱改变的影响明显不同,表明其对机体的影响可能存在不同的方式.
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丙型肝炎病毒全长cDNA克隆在Huh7细胞中的表达与复制
目的了解丙型肝炎病毒(HCV)在体外的复制和表达情况.方法利用HCV全长cDNA克隆构建表达质粒p3.1HCV并转染Huh7细胞.应用RT-PCR,Western blotting分析病毒正、负链RNA,蛋白表达和剪切.结果在转染p3.1HCV的Huh7细胞中可栓出相应病毒的正、负链RNA、Western blotting在转染p3.1HCV的Huh7细胞检测中可检到针对HCV NS3蛋白、分子量约70kD的特异性条带.结论HCV可以在体外培养的Huh7细胞中复制且其前体蛋白能在Huh7细胞中完成剪切.
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华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响
目的 研究华蟾毒配基联合索拉非尼对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响及作用机制.方法 MTT法检测Huh7细胞增殖;Hoechst33342/PI荧光双染法检测Huh7细胞凋亡形态变化;流式细胞仪检测细胞周期;免疫细胞化学法检测Ki67蛋白表达;Western blotting法检测Bax、Bcl-2、Caspase-8、极光激酶A(AURKA)、Ras、Raf、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p-ERK蛋白的表达变化.结果 华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药对Huh7细胞的增殖均有抑制作用,联合用药组的增殖抑制作用更明显,具有协同效应;荧光染色可见细胞凋亡形态变化;索拉非尼引起Huh7细胞周期S期阻滞,华蟾毒配基和联合用药引起Huh7细胞周期GE/M期阻滞,联合用药组G2/M期阻滞较单药组更明显;华蟾毒配基和索拉非尼均能减弱Ki67表达,联合用药组的作用更为显著;华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药上调Bax和Caspase-8蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax/Bcl-2比例,对ERK蛋白表达无明显影响,显著下调AURKA、Ras、Raf和p-ERK蛋白表达,联合用药组的作用更为显著(P＜0.05).结论 华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路抑制肝癌Huh7细胞增殖,诱导其凋亡.
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HBV影响TRIM22表达的机制及TRIM22 SNPs
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对肝癌细胞株Huh7细胞TRIM22表达的影响.方法 将Huh7细胞在不同浓度干扰素α(IFN-α)中培养24 h,采用实时定量PCR和Western Blot法检测TRIM22 mRNA和蛋白质表达;将HBV表达载体和空载体分别转染Huh7细胞,然后加入1 000 U/mL IFN-α中培养24 h,检测TRIM22 mRNNA和蛋白质表达.结果 Huh7细胞TRIM22 mRNA基础表达值低,可被IFN-α以剂量依赖的方式诱导表达上调,其中1 000 U/mL IFN-α组TRIM22 mRNA相对表达量为(213.29±43.51),明显高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05);转染HBV载体组TRIM22 mRNA相对表达量为(43.59±9.81),明显低于空载体组,差异有统计学意义(P<0.05);转染HBV载体组TRIM22蛋白质表达降低.结论 IFN-α可诱导Huh7细胞TRIM22表达,而HBV可抑制TRIM22表达.
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HBx蛋白羧基端30个氨基酸缺失对肝癌细胞生物学行为的影响
目的:探讨羧基端缺失了30个氨基酸的乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)突变体△HBx和野生型HBx对肝癌细胞Huh7生物学行为的影响.方法:脂质体介导pcDNA3△HBx和pcDNA3HBx重组体转染人HBV(一)的肝癌细胞Huh7.PCR扩增Neo基因及Western blot检测转染重组体.运用细胞生长曲线绘制、平板克隆形成、流式细胞仪和裸鼠成瘤实验对转染pcDNA3△HBx、pcDNA3HBx和pcDNA3的细胞生物学活性进行检测.结果:pcDNA3△HBx组细胞生长速度较pcDNA3HBx组和pcDNA3组减慢,其倍增时间延长;pcDNA3△HBx组克隆形成率较pcDNA3HBx组和pcDNA3组下降;细胞周期检测显示pcDNA3△HBx表达使Huh7细胞G0/G1期→S期的进程明显减慢.结论:HBx羧基端缺失了30个氨基酸的突变体比野生型HBx具有明显抑制细胞增殖的能力,提示该区域对于HBx功能发挥起着至关重要的作用.
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乙型肝炎病毒X蛋白羧基端30个氨基酸缺失突变体转染Huh7细胞的基因表达谱和蛋白质组差异分析
目的:本课题组既往研究显示乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)羧基端30个氨基酸的缺失突变体(△HBx)具有明显不同于野生型HBx(wtHBx)的细胞生物学效应,因此,本研究进一步探讨△HBx和wtHBx导致Huh7细胞差异生物学效应的分子基础.方法:采用cDNA芯片和双向凝胶电泳方法,从基因和蛋白质组水平,对分别转染了△HBx和wtHBx的Huh7细胞进行检测.结果:cDNA芯片检测结果显示,对比wtHBx组,△HBx组存在193个基因(0.95%)的显著性改变,154和39个基因分别显示表达上调和下调.双向凝胶电泳结果显示,对比wtHBx组,△HBx组存在147个蛋白差异点.基因表达谱和质谱分析结果显示,△HBx组差异表达的基因和蛋白主要涉及宿主细胞的基因转录、细胞连接、信号转导和代谢、免疫应答等过程及癌基因和抑癌基因.结论:HBx缺失突变体对细胞基因和蛋白质的影响是广泛的,涉及肝组织特异性的代谢基因的变化.这些差异表达的基因和蛋白质在HBx突变致癌过程中是否发挥了重要的作用,需要进一步的研究证实.
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HCV NS5B在人肝癌细胞系Huh7细胞内的表达及活性分析
目的 为靶向抗HCV药物筛选奠定基础.方法 使用脂质体将包含HCV非结构蛋白5B(NS5B)基因的重组载体pcDNA-5B转染至人肝癌细胞系Huh7细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot鉴定NS5B mRNA和蛋白表达,采用荧光素酶试验检测NS5B细胞内RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性.结果 转染的Huh7细胞出现1.8 kb的特异性NS5B mRNA目的带及一条相对分子质量约66 kD的蛋白目的带,且后者具有细胞内RdRp活性.结论 人肝癌细胞系Huh7细胞可成功表达具有细胞内RdRp活性的NS5B,以其为靶标的抗HCV药物可为临床治疗提供新思路.
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乙型肝炎病毒抑制Huh7细胞TRIM22表达的研究
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)是否影响肝癌细胞株Huh7细胞TRIM22的表达.方法 将干扰素α(IFN-α)加入Huh7细胞培养液中共培养,24 h后实时定量PCR、Western blot,分别在RNA及蛋白质水平检测TRIM22表达.然后用脂质体将HBV表达载体pBlue-HBV及空载体分别转染Huh7细胞,再加入IFN-α共培养,24 h后实时定量PCR、Western blot,分别在RNA及蛋白质水平检测TRIM22表达.用t检验比较组间差异,统计学分析采用统计产品与服务解决方案SPSS 16.0软件.结果 IFN-α可在RNA及蛋白质水平诱导Huh7细胞表达TRIM22.转染pBlue-HBV表达载体的Huh7细胞TRIM22表达水平低于转染空载体的细胞.结论 HBV可抑制IFN-α诱导的TRIM22表达,HBV可能通过抑制TRIM22表达而拮抗IFN的抗病毒作用,导致HBV持续感染.
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花青素抗氧化损伤及细胞凋亡的作用研究
目的:探索花青素对H2O2引起的Huh7细胞氧化应激、细胞凋亡的作用及其机制.方法:对H2O2和花青素干预培养的Huh7细胞,应用MTT法检测细胞活力,荧光探针DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)生成量,免疫印迹测定Akt、磷酸化激活的c-Jun蛋白水平.结果:H2O2 0.8mmol/L孵育1小时可显著诱导Huh7细胞损伤,细胞活力下降到(49.27±3.2)%,ROS生成量是未处理细胞的3.56倍.细胞经花青素50μmol/L与H2O2共孵育后,细胞存活率提高到(81.2±2.34)%;花青素能显著抑制H2O2引起的Huh7细胞ROS生成,ROS生成下降74%(P＜0.01).花青素抑制H2O2引起Huh7细胞死亡和ROS生成的效应随剂量增加而加强.花青素抑制H2O2激发Huh7细胞磷酸化c-Jun表达,提高细胞Akt水平.结论:花青素抑制H2O2引起的Huh7细胞氧化应激损伤所导致的细胞死亡,其作用机制在于减少细胞内活性氧生成,抑制H2O2激活磷酸化c-Jun,提高细胞Akt水平.
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GPR49基因对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响
目的：探讨肝癌细胞系 Huh7细胞中 G 蛋白偶联受体49（GPR49）基因对肝癌细胞侵袭能力的影响及其分子生物学机制。方法根据转染的小干扰 RNA （si-RNA）不同，将 Huh7细胞分为 GPR49-siRNA （si-GPR49）组和阴性对照 NC-siRNA （si-NC）组，另设未转染 Huh7细胞为对照组（control 组）。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和 Western blot 法分别检测3组细胞 GPR49、细胞周期素 D1（cyclin D1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）的信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表达。采用 MTT 法和 Transwell 法分别检测各组细胞增殖能力和侵袭能力。结果 si-GPR49组 GPR49 mRNA 的相对表达量为 control 组的（23.8±3.1）％（P ＜0.05）。与 control 组相比，si-GPR49组 GPR49、cyclin D1、MMP9蛋白的表达量均明显降低（均为 P ＜0.05）。MTT 检测细胞增殖能力实验结果显示， si-GPR49组细胞在72 h 的吸光度（OD）值（0.53±0.12）明显低于 control 组（1.35±0.28），差异有统计学意义（P ＜0.05）。si-GPR49组平均穿膜细胞数为（13.6±2.5）个，明显低于 control 组的（65.3±6.1）个，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论 GPR49-siRNA 可抑制 Huh7细胞 GPR49基因表达。其机制可能是通过降低 cyclin D1水平抑制 Huh7细胞的增殖能力，通过影响 MMP9蛋白表达水平抑制 Huh7细胞的迁移和侵袭能力。
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表儿茶素对H2O2引起的Huh7细胞氧化应激的作用
2O2激活磷酸化c-Jun ,提高细胞Akt, PCNA水平.
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pSG5/NS5A5B△C质粒的构建及在Huh7细胞中的表达
目的:构建pSG5/NS5A5B△C质炷,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达.方法:使用已经构建的pTM1-△C质粒,并检验其在NS2NS5A5B△C质粒为模板,根据pTM1、HCV NS5A5B△C、pSG5序列和酶切位点特点设计引物,PCR扩增得到HCVNS5ASB△C基因片段,将目的片段插入psG5载体中,经筛选阳性克隆、Sac Ⅰ和Bg/Ⅱ分别酶切鉴定后,用FuGene 6转染试剂转染入Huh7细胞.用免疫荧光染色、Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh-7细胞中的表达.结果:限制性内切酶Sac Ⅰ和BglⅡ分别酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致.荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白,该蛋白主要表达于细胞质,表达率达40%以上.Western blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C(82 ku)一致的条带.结论:成功构建了pSGS/NS5A5B△C质粒,并在Huh7细胞中成功瞬时表达,为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础.
