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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的:观察研究半边旗中二萜类化合物5F(1la-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株AsPC-1凋亡的效果及其机制.方法:用脂质体转染法将PUMA/siRNA导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为8.875μmol·L-1、37.5μmol·L-1、142μmol·L-1的5F中作用72h.RT-PcR检测不同组细胞经5F作用24h后的PuMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Hoechst33258和PI双染色染色了解细胞凋亡的变化.结果:5F促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当PUMA表达抑制后,受5F作用的细胞出现PUMA表达的降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖.结论:5F促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制其生长,其诱导凋亡与上调PUMA有关.
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Puma表达下调对人脐血CD34+造血细胞抗放射作用的初步研究
Puma属于BCL-2家族中BH3-only亚家族,动物和细胞研究发现其通过p53依赖和非依赖途径诱导细胞凋亡,并具有抗放射保护不增加肿瘤发生率的作用.本研究检测Puma基因敲降后对人脐血CD34+造血干祖细胞生物学功能的影响.应用RT-PCR、Western Blot检测Puma基因在辐射刺激条件下的表达,采用慢病毒感染人脐血CD34+细胞分选GFP+细胞,Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡,Ki67染色检测细胞周期,CCK-8、Brdu标记法检测细胞增殖能力,并进行集落形成实验(colony formig cell assay,CFC).结果表明:Puma基因表达量随着射线强度的增加而增高,Puma基因表达下调抑制造血祖细胞体外集落形成能力和体外增殖能力.在辐射刺激条件下,抑制Puma基因表达可以减少人脐血CD34+细胞凋亡,维持细胞周期于G0期.结论:人脐血CD34+造血干细胞中Puma基因敲降具有一定的抗辐射作用,维持细胞于静息状态.
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PUMA基因转染对胰腺癌细胞生长的影响
目的 探讨PUMA基因转染抑制胰腺肿瘤生长的体内外效果.方法 利用脂质体转染法将表达PUMA的质粒转染导入胰腺癌细胞株PC-3中,G418筛选出阳性克隆,Western和RT-PCR法检测PUMA转染后PC-3 PUMA的表达,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率;分别将转染PUMA的PC-3细胞(实验组)和未转染的PC-3细胞移植到裸鼠体内,比较裸鼠移植肿瘤的大小和重量以及PUMA表达.结果 PUMA表达质粒转染的PC-3细胞(PC-3/PUMA)稳定表达PUMA,其细胞凋亡率为(5.50 ± 0.90)%,明显高于未转染组的(1.073 ± 0.248)%和空载体转染组的(1.08 ± 0.35)%(P ＜0.05);裸鼠接种4周后PC-3/PUMA细胞成瘤率为70%,PC-3细胞和空载体PC-3细胞成瘤率为100%(P ＞ 0.05),PC-3/PUMA细胞形成的肿瘤体积比PC-3细胞和空载体PC-3细胞明显减小(P ＜0.05),并且形成的肿瘤组织中PUMA高表达.结论 胰腺癌细胞中缺失PUMA基因表达,PUMA转染胰腺癌细胞后表达PUMA,并能促进细胞凋亡.
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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的:观察研究半边旗中二萜类化含物5F(11-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺痛细胞株PC-3凋亡的效果及其机制.方法:在体外培养的胰腺癌细胞株PC-3中加入8.875umol/L,37.5umol/L,142umol/L浓度的5F孵育24h,RT-PCR分析各组细胞中mRNA-PUMA表达,MTT检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡.利用Lipofectamine<'TM>2000将人类SiRNA-PUMA转染导入胰腺癌细胞PC-3中抑制PUMA的表达后,观察转染96h后的细胞株PC-3在上述浓度的5F的作用下各组细胞中mRNA-PUMA的表达、细胞凋亡以及细胞生长的变化结果:在5F作用下,细胞mlLNA-PUMA表达提高,细胞存活率随着药物浓度的提高明显降低,细胞凋亡率随着药物浓度的提高而明显提高,且呈量效关系:转染siRNA-PUMA后的细胞在5F作用下,细胞中mRNA-PbMA未见明显表达,细胞存活率和凋亡率与对照组比无显著性改变.结论:5F可能通过上调PUMA基因表达而促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.
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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的 观察研究半边旗中二萜类化合物5F(1la-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株PC-3 凋亡的效果及其机制.方法 在体外培养的胰腺癌细胞株PC-3中加入8.875umol/L,37.5umol/L,142umol/L浓度的5F孵育24h,RT-PCR分析各组细胞中mRNA-PUMA表达,MTT检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡.利用Lipofectamine.2000将人类siRNA-PUMA转染导入胰腺癌细胞PC-3中抑制PUMA的表达后,观察转染96h后的细胞株PC-3在上述浓度的5F的作用下各组细胞中mRNA-PUMA的表达、细胞凋亡以及细胞生长的变化.结果 在5F作用下,细胞mRNA-PUMA表达提高,细胞存活率随着药物浓度的提高明显降低,细胞凋亡率随着药物浓度的提高而明显提高,且呈量效关系;转染siRNA-PUMA后的细胞在5F作用下,细胞中mRNA-PUMA未见明显表达,细胞存活率和凋亡率与对照组比无显著性改变.结论 5F可能通过上调PUMA基因表达而促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.
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PUMA基因转染胰腺癌AsPC-1细胞增强对5-FU致凋亡的敏感性
目的:探讨PUMA基因转染是否增强胰腺癌AsPC-1细胞对5-FU致凋亡的敏感性.方法: 采用脂质体转染法将PUMA-pCEP4和空载体pCEP4质粒转染入胰腺癌AsPC-1细胞中,G418筛选阳性细胞.将系列浓度(0.01～100 μmol/L)的5-FU 分别作用于AsPC-1、AsPC-1/PUMA和AsPC-1/pCEP4细胞72 h,MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50, FCM、断裂DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL法检测细胞凋亡情况,Western blotting检测各组细胞PUMA蛋白表达的变化.结果: AsPC-1、AsPC-1/PUMA和AsPC-1/pCEP4细胞的5-FU IC50分别为(12±1.9)、(1.6±0 4)和(10.4±1.6)μmol/L,AsPC-1/PUMA细胞对5-FU作用的敏感性增加了7.5倍.5-FU以剂量依赖方式诱导AsPC-1细胞凋亡,但对AsPC-1/PUMA细胞所诱导的凋亡比AsPC-1和AsPC-1/pCEP4 更明显.低浓度5-FU(0.1 μmol/L)轻微引起AsPC-1/pCEP4[(1.14±0.28)%]和AsPC-1细胞凋亡[(0.9±0.23)%],但能诱导AsPC-1/PUMA细胞明显凋亡[(6.47±1.42)%];高浓度5-FU (1μmol/L)诱导各组细胞凋亡,但AsPC-1/PUMA细胞凋亡率[(34.54±9.36)%]明显高于AsPC-1[(12.8±3.74)%]和AsPC-1/pCEP4细胞[(15.8±5.15)%],差异均有统计学意义(P<0.01);FCM、断裂DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测显示相同的结果.PUMA蛋白在AsPC-1/PUMA细胞中的表达明显高于AsPC-1和AsPC-1/pCEP4细胞.结论: PUMA基因转染明显地增强了胰腺癌AsPC-1细胞对5-FU致凋亡作用的敏感性.
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EB病毒编码miR-BART5作用于PUMA基因抑制肺癌细胞凋亡
目的 探讨肺癌组织中EB病毒(EBV)感染情况、EBV编码miR-BART5在肺癌组织中表达及对肺癌细胞凋亡的影响.方法 采用实时荧光定量PCR技术检测非小细胞肺癌组织和肺良性病变组织中EBV DNA载量及EBV编码miR-BART5的表达情况;在宣威肺腺癌细胞系中构建PUMA基因和miR-BART5表达载体,利用荧光素酶报告系统验证PUMA与miR-BART5关系.使用噻唑蓝比色法(MTT)分析转染后不同时间段细胞增殖情况.通过caspase3/7、9活性检测研究miR-BART5、PUMA基因在肺癌细胞凋亡中的作用.结果 30例肺癌组织中EBV DNA阳性11例(36.67％),30例肺良性病变组织中均阴性.miRNA-BART5在EBV阳性肺癌组织中表达量(3.46±0.54)明显高于EBV阴性肺癌组织(1.98±0.46)和EBV阴性肺良性病变组织(1.12±0.32),差异有统计学意义(P均＜0.05);EBV阴性肺癌组织与EBV阴性肺良性病变组织中miRNA-BART5表达差异无统计学意义(P＞0.05).荧光素酶报告基因分析显示,miR-BART5能够作用于PUMA基因3'UTR端.MTT结果显示,转染0、24、48、72 h后,miR-BART5组吸光度(A)值分别为0.8、0.93、1.18、1.2,细胞正常增殖;无意义序列(scrambled siRNA)转染组A值分别为0.71、0.80、0.90、0.99,生长未受到明显抑制;miR-BART5过表达(Over-miR-BART5)载体转染组A值为0.90、0.99、1.57、2.20,与miR-BART5组相比均增加;miR-BART5抑制表达(In-miR-BART5)载体转染组A值为0.70、0.67、0.56、0.48,与miR-BART5组相比,在转染24h后出现明显抑制,且随时间的推移,抑制程度越明显;miR-BART5过表达载体转染组中caspase3/7、9活性(3 646 ±334、5 533±112)相对于miR-BART5抑制表达载体转染组中caspase3/7、9活性(10 145±398、10 576±915)显著降低.结论 肺癌组织中EBV呈现较高的感染率;在EBV DNA阳性肺癌细胞中,miR-BART5可能通过抑制PUMA基因的表达进而抑制肺癌细胞凋亡.
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PUMA在奥沙利铂治疗大肠癌中作用机制的实验研究
目的:研究凋亡相关基因PUMA在奥沙利铂(oxaliplatin)治疗大肠癌药物机制中的作用,为更好地发挥奥沙利铂的抗肿瘤作用提供实验基础.方法:蛋白印迹法检测在大肠癌LoVo细胞株中奥沙利铂对PUMA蛋白表达的诱导作用;构建稳定表达反义PUMA基因的重组质粒及细胞系;流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法测定细胞增殖.结果:成功构建表达反义PUMA基因的重组质粒及细胞系;在大肠癌LoVo细胞株中,奥沙利铂可以诱导PUMA的表达,并在一定范围内呈时间和剂量依赖关系;在PUMA的表达受抑制后,奥沙利铂诱导大肠癌细胞凋亡的作用明显减弱.结论:PUMA的表达在奥沙利铂诱导LoVo细胞凋亡的过程中具有重要作用,PUMA表达的抑制会降低大肠癌LoVo细胞对奥沙利铂治疗的敏感性.
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Puma基因转染对胃癌SGC-7901细胞的促凋亡作用及机制
[目的]探讨puma基因转染对人胃癌SGC-7901细胞株增殖和凋亡的影响及其作用机制.[方法]应用脂质体介导重组真核表达载体pEGFP-C1-PUMA瞬时转染至SGC-7901细胞.分别用荧光显微镜和RT-PCR法检测外源基因的表达.MTT比色法测定细胞增殖的抑制.Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期和线粒体膜电位的变化,Western blot检测细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)的转位.[结果]外源性puma基因在pEGFP-C1-PUMA转染的SGC-7901细胞中实现了表达.PUMA表达使SGC-7901细胞的增殖能力降低并诱导凋亡,转染24、48、72h的生长抑制率分别为19.3%、34.7%、42.2%,凋亡率分别为19.6%、35.4%、46.6%.PUMA表达的SGC-7901细胞DNA合成受到抑制,周期阻滞在G0/G1期;线粒体膜电位明显下降,Cyt C、AIF从线粒体进入胞浆.[结论]puma基因转染可有效抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖,促进其凋亡.促凋亡机制主要是线粒体途径,与线粒体膜电位降低和Cyt C、AIF从线粒体释放有关.
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γ射线诱导下PUMA基因在人前列腺癌细胞中的作用
目的 研究在γ射线诱导下PUMA基因(p53 up-regulated modulator of apoptosis)在人前列腺癌细胞(p53野生型LNCaP细胞、p53变异型PC-3细胞)中的作用效果.方法 采用MTT方法检测在3、5、8 Gy照射剂量的γ射线诱导下人前列腺癌细胞的抑制率;采用RT-PCR的方法检测在3、5、8 Gy照射剂量的γ射线诱导下PUMA基因的表达情况.结果 在γ射线诱导下LNCaP细胞抑制率较PC-3细胞抑制率高(P<0.01);随γ射线照射剂量的增加,LNCaP细胞中PUMA-mRNA的表达越明显(P<0.05).结论 γ射线诱导下PUMA基因可促使人前列腺癌LNCaP细胞凋亡.
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PUMA基因在肿瘤治疗方面的研究进展
p53上调凋亡调控因子(PUMA)是近年发现的Bcl-2家族成员,因其可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用而在生命科学的研究领域受到广泛关注.PUMA不仅能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,还能增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性,是非常有前景的肿瘤基因治疗靶点.也有新的研究发现PUMA还在肿瘤发生过程中承担着更多的生物学功能.
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5F对胰腺癌细胞生长的影响及机制
目的:观察研究半边旗中二萜类化合物5F(1la-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株AsPC-1凋亡的效果及其机制.方法:用脂质体转染法将PUMA/siRNA导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度8.875,37.5,142 μmol/L浓度的5F中作用72 h.RT-PCR检测不同组细胞经5F作用24 h后的PuMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Hoechst33258和PI双染色染色了解细胞凋亡的变化.结果:5F促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当PUMA表达抑制后,受5F作用的细胞出现PUMA表达的降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖.结论:5F促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制其生长,其诱导凋亡与上调PUMA有关.
