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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的:观察研究半边旗中二萜类化合物5F(1la-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株AsPC-1凋亡的效果及其机制.方法:用脂质体转染法将PUMA/siRNA导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为8.875μmol·L-1、37.5μmol·L-1、142μmol·L-1的5F中作用72h.RT-PcR检测不同组细胞经5F作用24h后的PuMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Hoechst33258和PI双染色染色了解细胞凋亡的变化.结果:5F促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当PUMA表达抑制后,受5F作用的细胞出现PUMA表达的降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖.结论:5F促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制其生长,其诱导凋亡与上调PUMA有关.
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小鼠体内半边旗5F微乳剂的药动学及组织分布特征
目的:考察半边旗抗癌二萜5F口服微乳剂在小鼠体内的组织分布及药物代谢动力学.方法:采用Hypersil C18(4.6 mm×250mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.5％冰醋酸(55∶45),流速0.8 mL· min-,进样20 μL,柱温35℃.小鼠灌胃给药5F微乳剂与普通制剂后,在不同时间点取血及内脏器官,样品经处理后,采用反相高效液相色谱法测定血清及组织匀浆液中5F的浓度,分析其体内药物代谢动力学和组织分布.结果:小鼠半边旗5F微乳剂药动学参数分别为AUC0→t12.202μg·L-1·h-1,Cmax=3.434 μg·L-1和Tmax=1.048 h,MRT0→12.451 h,相对生物利用度为对照组616.15％.结论:半边旗5F微乳剂口服生物利用度提高,消除半衰期延长,具有一定的缓释作用.
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半边旗5F注射液的质量标准研究
目的:建立半边旗注射液的质量标准.方法:采用薄层色谱法对半边旗注射液进行鉴别;采用高效液相色谱法测定主要成分11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸(5F)的含量,色谱柱为Hypersil C18(4.6 mm ×250 mm,5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(55:45:0.045),检测波长254 nm,流速1.0 mL·min-1,柱温35℃;采用pH计法、离子火焰法和沉淀法分别测定注射液pH,K+、鞣质、蛋白质、草酸盐以及重金属含量.结果:薄层鉴别斑点清晰,重现性好.高效液相色谱法测定5F在30～240 nag·L-1线性关系良好(r=0.999 8),平均加样回收率为99.8%.连续3批注射液pH 7.80～8.20,K+浓度小于10 mmol·L-1,注射液的鞣质、蛋白质、草酸盐以及重金属含量都符合药典规定.结论:本实验建立的分析方法灵敏可靠,可作为半边旗注射液的质量控制方法.
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半边旗二萜化合物5F对HO-8910PM细胞中Nr1d1表达的影响
目的:研究半边旗二萜化合物5F(5F from Pteris semipinnata L,PsL5F)对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞中核受体超家族成员1d1(nuclear receptor subfamily 1,group D,member 1,Nr1d1)表达的影响,探讨其抗肿瘤的可能作用机制.方法:培养HO-8910PM细胞,用0.1%DMSO,100 μmol~(-1) PsL5F分别处理HO-8910PM细胞24 h后,提取RNA和总蛋白,应用肿瘤基因芯片和荧光定量实时PCR检测PsL5F对Nr1d1 mRNA表达的影响;Western blot法分析PsL5F对Nr1d1蛋白表达水平的影响.结果:肿瘤基因芯片结果显示,100μmol·L~(-1) PsL5F处理组中Nr1d1 mRNA表达水平是对照组的26.17倍,荧光定量实时PCR结果与芯片结果吻合,PsL5F处理组中Nr1d1 mRNA表达水平是对照组的(35.34±1.07)倍(P<0.01),并且PsL5F处理组中Nr1d1蛋白表达水平是对照组的(7.71±0.43)倍(P<0.01).结论:PsL5F能明显上调HO-8910PM细胞中Nr1d1的表达,提示其与PsL5F抗肿瘤作用密切相关.
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ROS不参与Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid诱导的HepG2细胞凋亡
目的:确定活性氧(ROS)生成在Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F)所诱导的HepG2细胞凋亡中的作用.方法:采用MTT分析检测5F对HepG2细胞增殖的影响,再以Hoechst/PI法分析凋亡细胞的形态变化.为了评价细胞内ROS水平,采用了GENMED试剂盒.HepG2细胞经5F处理24 h,或1 mmol·L-1GSH预处理1 h再经5F处理24 h,然后以Cell Death Detection ELISA试剂盒检测胞浆核小体片段.结果:通过细胞活性分析证实,5F对HepG2的细胞毒作用随着5F浓度升高而增强.而凋亡变化,如染色质浓缩,则被Hoechst/PI染色所证实.经5F处理的HepG2细胞内ROS生成减少被观察到.5F诱导的胞浆核小体片段并不由于GSH降低ROS介导的信号转导水平而发生变化.并且,顺铂(CDDP)诱导的ROS生成可被5F清除,同时5F还显示了与CDDP协同杀伤细胞作用.结论:5F不仅能通过非ROS依赖途径诱导细胞凋亡,还可缓解氧化应激.
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半边旗提取物对HL-60细胞的细胞毒作用及对细胞周期的影响
目的:研究蕨类植物半边旗提取物对HL-60细胞的体外杀伤作用及对细胞周期的影响.方法:用噻唑蓝(MTT)法测定细胞成活率;用流式细胞术测定细胞周期时相分布.结果:半边旗乙醇总提取物PSE及纯化合物5F、6F及A对HL-60细胞有强烈的杀伤作用,具明显的时间和剂量效应;PSE、5F、6F及A作用HL-60细胞24 h后,Go/G1期细胞比例明显下降,S期细胞比例明显升高,G2/M期轻度升高(5F作用组例外).结论:半边旗提取物对HL-60细胞有强烈的杀伤作用,明显影响细胞周期时相分布.肿瘤防治杂志,2001,8(4):348-350
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半边旗二萜类化合物5F对人翼状胬肉成纤维细胞增殖周期和Ki-67表达的影响
目的:观察中药半边旗二萜类化合物5F对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖周期和Ki-67表达的影响.方法:用流式细胞仪(FCM)分析不同浓度5F对HPF周期分布、免疫细胞化学法(ICH)检测5F对增殖指数Ki-67抗原的影响.结果:用药后HPF停滞于G1期,S、G2/M期细胞减少;Ki-67阳性表达率对照组为(26.16±1.26)%,5F浓度8 μg/ml时下降,在128 μg/ml时降至(4.10±0.63)%.各用药组与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01).各用药组间两两比较有显著性差异(P＜0.01).结论:5F对HPF增殖的抑制作用与细胞周期、Ki-67阳性表达降低有关.
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半边旗二萜类化合物5F对人翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用
目的观察中药半边旗二萜类化合物5F对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞( human pterygium fibroblasts, HPF)增殖的影响.方法用噻唑蓝比色法(MTT)观察不同浓度梯度(4、8、16、32、64、128μg/ml)的5F在不同作用时间内(24、48、72、96小时)对HPF增殖的抑制作用.结果用药24小时浓度16μg/ml开始明显抑制(P＜0.05);48小时8μg/ml抑制作用更强(P＜0.01);50%抑制率(IC50)浓度32μg/ml.同一浓度各时间组抑制率(IR)与对照组比较,在4μg/ml作用24、48及72小时IR与对照组比较差异均无显著性(P＞0.05),持续作用96小时差异有显著性(P＜0.01);16μg/ml以上24～96小时各时间组IR与对照组比较差异均有显著性(P＜0.01).结论体外培养HPF具较强增殖能力,5F对HPE的增殖具明显抑制作用,并与用药剂量和持续时间有相关性.
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半边旗5种成分体外细胞毒活性比较及构效关系分析
用多种人癌细胞株以MTT试验,体外筛选半边旗抗肿瘤活性成分.结果显示:化合物5F,6F,A及半边旗乙醇提取物PSE对5种人癌细胞均有不同程度的杀伤作用,且呈明显的剂量依赖关系.其中6F的活性强,其次是A,5F,而化合物4F和B对5种细胞均无细胞毒活性.分析它们的构效关系可以推测,α-β-亚甲基环戊酮结构是其活性部位,结构中羟基数目和位置的不同可以影响化合物的活性强度.
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HPLC-APCI-MS分析半边旗中二萜类化合物
目的建立一种准确可靠的分析半边旗中二萜类化合物的方法.方法用高效液相色谱(HPLC)-大气压化学电离源(APCI)-质谱(MS)联用的方式,以选择离子监测(SIM)方式进行测定.主要的二萜类化合物5F和4F的准分子离子为[M-H]-1,发生源内分子离子碰撞活化解离(CID)现象时,出现[M-H]-1和[M-H2O-H]-1离子峰.采用[M-H]-1为选择监测离子,以色谱保留时间和选择监测离子流峰面积定量,优选质谱条件和色谱条件.分析色谱柱为Diamonsil ODS,4.6 mm×150 mm,流动相为30% CH3CN-70% 2 mmol*L-1 NH4Ac,流速1.0 mL*min-1,进样5 μL.以测定半边旗中二萜类化合物5F为例,对此方法进行了应用.结果半边旗中二萜类化合物5F为1.18 mg*g-1,方法线性范围0.05～2.5 μg,相关系数均优于0.999,检出限达0.4 ng(进样5 μL).5F的加标回收率为97.8%(n=3),5F保留时间为4.3 min.结论本法灵敏、准确、可靠,可应用于半边旗中二萜类抗癌化合物的深入研究和生药标准的制定.
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半边旗5F注射液中有效成分的含量测定方法
目的:建立半边旗5F(化学名为11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸)注射液中有效成分的含量测定方法.方法:采用高效液相色谱法测定主要成分5F的含量,色谱柱为Hypersil C18(250 mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(55:45:0.045),检测波长为254 nm,流速为1.0 mL·min-1,柱温为35℃.结果:高效液相色谱法测定5F的含量在30～240 mg·L-1范围内线性关系良好(r=0.999 8),平均加样回收率为99.8%.结论:本实验所建立的分析方法灵敏可靠,可作为半边旗5F注射液中有效成分的定量分析方法.
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半边旗提取物6F抑制HL-60细胞蛋白激酶C活性
目的探讨半边旗提取物6F的细胞毒作用及诱导DNA片段化与蛋白激酶C(PKC)信号转导途径的关系,检测6F对PKC活性的影响.方法受试对象为HL-60细胞,超速离心法获得的胞液(可溶部分)及颗粒(不可溶部分,包括细胞膜系统及胞核)部分用作PKC活性测定.经0.4 g@L-1磷脂酰丝氨酸,0.04g@L-1甘油二油酸酯激动剂作用酶粗提物后,用液体闪烁计数仪计数[γ-32P]ATP参入外源底物的量以测定PKC活性.MTT法测定HL-60细胞的活力,二苯胺法测定6F诱导DNA片段化程度.结果在所测试的浓度范围内(0.5～312 μmol@L-1),化合物6F显著抑制胞液及颗粒部分PKC活性,大抑制率达88.6%,呈浓度依赖关系(胞液部分r=0.781,P＜0.05,颗粒部分r=0.931,P＜0.01).6F诱导HL-60细胞DNA片段化及对细胞的毒性作用可被具有致癌作用的PKC激活剂肉豆蔻酸酯(PMA,浓度为65 nmol@L-1)拮抗,抑制率分别是30%和44%(P＜0.01).PMA单独用使HL-60细胞线粒体将MTT还原为甲臜的能力增强14%(P＜0.01),即增强细胞活力.结论化合物6F是PKC的抑制剂.6F对HL-60细胞DNA片段化的诱导作用及其细胞毒作用至少可部分归因于其对PKC活性的抑制作用.
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半边旗二萜类化合物5F诱导人翼状胬肉成纤维细胞凋亡及对caspase-3表达的研究
目的观察半边旗二萜类化合物5F(5F)对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)的致凋亡作用及其对凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达的影响.方法采用5F不同药物浓度组(0,8,32,128 mg·L-1)作用不同时间处理细胞.噻唑蓝比色法检测5F对细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期及凋亡;RT-PCR检测细胞内凋亡相关基因caspase-3的转录水平;Western blot检测细胞caspase-3蛋白表达;化学比色法检测细胞凋亡过程中caspase-3活性的变化.结果给药组细胞的生长与对照组相比均受到显著的抑制(P＜0.01),细胞增殖抑制率呈剂量和时间的依赖关系;Hoechst33258荧光染色显示,给药组部分细胞呈典型的凋亡表现;流式细胞术检测在32 mg·L-1浓度作用下,12 h即出现"凋亡峰",其峰值达(12.48±1.29)%;RT-PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase-3 mRNA表达上调;Western blot检测细胞caspase-3蛋白表达水平升高;caspase-3活性检测显示,其活性呈剂量和时间依赖性增高,5F浓度达到128 mg·L-1时,其活性为对照组的3.52倍.结论5F可显著地抑制HPF增殖、诱导细胞凋亡、升高caspase-3活性,并呈明显的量效与时效关系;其诱导细胞凋亡的作用机制可能与升高caspase-3活性,促进caspase-3基因转录和蛋白翻译,使细胞内caspase-3增加从而促进细胞凋亡有关.
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高效液相色谱法测定半边旗抗肿瘤有效成分5F的含量
目的建立半边旗抗肿瘤有效成分11α-羟基-15-氧-16烯-对映贝壳杉烷-19-酸(5F)的HPLC定量测定方法.方法流动相由乙腈-甲醇-50 mmol*L-1醋酸盐缓冲液(30∶5∶65,pH4.1)组成;流速1.0 mL*min-1,检测波长242 nm.结果 5～150 mg*L-1范围内呈线性(r=0.999 7), 日内、日间RSD 1.8%～4.8%,回收率95.5%.结论该方法精密度高、专一性好、能准确检测半边旗5F含量.
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薄层色谱法鉴别半边旗和刺齿半边旗
目的:研究半边旗和刺齿半边旗化学成分的差异,促进用药安全、有效.方法:采用薄层色谱法,展开剂为石油醚:丙酮:冰醋酸(7:3:0.05).结果:二者薄层斑点数目不同,荧光显色也有区别.结论:两种药材的化学成分有差异,不能盲目等同使用.
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中国凤尾蕨属植物的研究概况
凤尾蕨属(Pteris.L.)植物,在国内可以找到大约66种［1］,根据中医古书记载,能够将其用作药物的有24种［2,3］。在近几年的相关报道中,科学家对本属植物半边旗(P.semipinnata L.)有了更加深入的了解,发现其中存在着几种高效低毒的抗肿瘤成分,并对其构效关系进行了详细的分析和研究［4］,本文根据相关的报道总结出1970~2006年间凤尾蕨类植物属中获得的化学成分和抗肿瘤药用植物。
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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的:观察研究半边旗中二萜类化含物5F(11-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺痛细胞株PC-3凋亡的效果及其机制.方法:在体外培养的胰腺癌细胞株PC-3中加入8.875umol/L,37.5umol/L,142umol/L浓度的5F孵育24h,RT-PCR分析各组细胞中mRNA-PUMA表达,MTT检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡.利用Lipofectamine<'TM>2000将人类SiRNA-PUMA转染导入胰腺癌细胞PC-3中抑制PUMA的表达后,观察转染96h后的细胞株PC-3在上述浓度的5F的作用下各组细胞中mRNA-PUMA的表达、细胞凋亡以及细胞生长的变化结果:在5F作用下,细胞mlLNA-PUMA表达提高,细胞存活率随着药物浓度的提高明显降低,细胞凋亡率随着药物浓度的提高而明显提高,且呈量效关系:转染siRNA-PUMA后的细胞在5F作用下,细胞中mRNA-PbMA未见明显表达,细胞存活率和凋亡率与对照组比无显著性改变.结论:5F可能通过上调PUMA基因表达而促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.
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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的 观察研究半边旗中二萜类化合物5F(1la-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株PC-3 凋亡的效果及其机制.方法 在体外培养的胰腺癌细胞株PC-3中加入8.875umol/L,37.5umol/L,142umol/L浓度的5F孵育24h,RT-PCR分析各组细胞中mRNA-PUMA表达,MTT检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡.利用Lipofectamine.2000将人类siRNA-PUMA转染导入胰腺癌细胞PC-3中抑制PUMA的表达后,观察转染96h后的细胞株PC-3在上述浓度的5F的作用下各组细胞中mRNA-PUMA的表达、细胞凋亡以及细胞生长的变化.结果 在5F作用下,细胞mRNA-PUMA表达提高,细胞存活率随着药物浓度的提高明显降低,细胞凋亡率随着药物浓度的提高而明显提高,且呈量效关系;转染siRNA-PUMA后的细胞在5F作用下,细胞中mRNA-PUMA未见明显表达,细胞存活率和凋亡率与对照组比无显著性改变.结论 5F可能通过上调PUMA基因表达而促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.
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半边旗提取物5F诱导HepG2细胞凋亡与p53活化及血管内皮生长因子抑制有关
目的 观察半边旗提取物Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F)对人肝癌细胞HepG2增殖的影响,并探讨p53、血管内皮生长因子(VEGF)及Caspase-3在5F诱导的HepG2细胞凋亡中的作用.方法 采用MTT分析检测5F对HepG2细胞增殖的影响,并通过细胞凋亡检测ELISA试剂盒分析经5F处理的HepG2细胞胞浆核小体片段,以确定5F能否诱导细胞凋亡.采用Hoechst/PI分析鉴定凋亡细胞核形态.通过免疫印迹(Western blotting)分析测定p53及VEGF蛋白表达水平,并通过Caspases-3分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3活性.结果 通过细胞活性分析证实,5F对HepG2的细胞毒作用随着5F质量浓度的升高而增强.5F诱导HepG2产生胞浆核小体片段,并且该诱导作用具有剂量依赖性.5F处理后,凋亡变化,如染色质浓缩,被Hoechst/PI染色所确定.5F处理后HepG2细胞核内p53表达水平显著提高,而胞浆VEGF表达水平却下降,同时,Caspase-3活性通过浓度依赖方式增强.结论 5F所诱导的HepG2细胞凋亡与p53及Caspase-3活化、VEGF负调控有关.5F可能具有抗癌尤其是抗肝细胞癌价值.
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半边旗二萜类化合物5F对人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM NF-κB(P65)、Smad3蛋白和NF-κB(P65)、ETS-1 mRNA表达的影响
目的研究半边旗二萜类化合物5F(11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝克杉烷-19酸)对人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM细胞内核转录因子κBP65亚基[NF-κB(P65)]、Smad3蛋白及NF-κB(P65)、ETS-1 mRNA表达的影响,探讨其抗肿瘤的作用机制.方法MTT法检测5F对HO-8910PM细胞增殖的影响;Western blot分析NF-κB(P65)及Smad3蛋白的表达;RT-PCR分析NF-κB(P65)及ETS-1 mRNA的表达.结果5F能抑制HO8910PM细胞的增殖,抑制率随剂量的增加而增加,具有剂量依赖性;25～100μmol/L 5F作用HO-8910PM细胞24 h后,NF-κB(P65)、Smad3蛋白表达水平明显下降,并呈剂量效应关系;5F明显下调NF-κB(P65)mRNA的表达,轻微下调ETS-1 mRNA的表达.结论5F抗肿瘤活性与NF-κB(P65)、Smad3蛋白和NF-κB(P65)、ETS-1mRNA的表达有关.
