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miR-135b-5p调控TIMP3的表达对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响
目的 探讨miR-135b-5p对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、转移的影响及其可能的机制.方法 使用Lipo-fectamine -2000将miR-135b-5p siRNA转染至SUNE-1细胞,并将NC siRNA转染至SUNE-1细胞中作为对照组.实时定量PCR检测NP69、CNE-1、SUNE-1、C666-1细胞系及鼻咽癌组织中miR-135b-5p及TIMP3的表达水平.双荧光素酶报告基因检测miR-135b-5p及TIMP3的调控关系,免疫蛋白印迹实验检测TIMP3蛋白的表达含量,CCK-8实验检验SUNE-1细胞的增殖能力,Transwell实验检验SUNE-1细胞的迁移及侵袭能力.miR-135b-5p的表达与鼻咽癌(NPC)患者的临床病理学参数之间的关联.结果 miR-135b-5p在CNE-1、SUNE-1、C666-1细胞系及鼻咽癌组织中表达含量均上升,并且在SUNE-1细胞系中其的表达水平低;双荧光素酶报告基因结果显示:抑制miR-135b-5p表达可显著增高SUNE-1细胞中TIMP3的荧光素酶活性;抑制miR-135b-5p表达后,TIMP3蛋白的表达相应上调,同时削弱了SUNE-1细胞增殖、迁移、侵袭能力.同时收集整理NPC患者相关临床资料进行对比分析,结果发现miR-135b-5p的表达与NPC的病理分期相关以及淋巴结转移情况呈正相关.结论 抑制miR-135b-5p的表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并靶向上调TIMP3的表达.
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胃癌TIMP3基因启动子甲基化及其蛋白表达的研究
目的:探讨组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissueinhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3)基因启动子甲基化与其蛋白表达的相关性,并分析TIMP3基因CpG岛异常甲基化与胃腺癌及其临床病理特征的关联性,方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)技术和免疫组织化学方法分别检测78例患者的胃正常黏膜组织、胃癌组织及转移淋巴结中,TIMP3基因启动子甲基化和蛋白表达情况.结果:胃正常黏膜组织、早期、进展期胃癌组织和转移淋巴结中TIMP3基因启动子均有甲基化修饰,其阳性率分别为35.9%(28/78);85.0%(17/20),89.7%(52/58);转移淋巴结100%(78/78).胃癌组TIMP3基因启动子甲基化率明显高于胃正常黏膜组(P＜0.05).胃正常黏膜组织TIMP3蛋白表达全部为阳性(100%),20例早期胃癌中,6例阳性(30%),58例进展期胃癌中,2例阳性(3.4%),在转移淋巴结中全部不表达(0%).胃癌70例蛋白表达阴性的标本中,64例TIMP3基因启动子甲基化阳性(91.4%),TIMP3蛋白表达与启动子甲基化呈明显负相关(P＜0.01).结论:启动子区CpG岛高甲基化是胃癌组织中TIMP3基因表达失活的主要机制,可能成为胃癌分子诊断与病期评估的标志之一.
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TIMP3、E-Cadherin基因在食管癌细胞系EC1和EC9706中的甲基化及蛋白表达
目的:观察食管癌细胞系EC1和EC9706中TIMP3、E-Cadherin基因甲基化的水平及蛋白表达,以及去甲基化药物5-Aza-CAR对其的影响.方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)和免疫细胞化学的方法,分别检测体外培养的食管癌细胞系EC1和EC9706中TIMP3和E-Cadherin基因甲基化水平及蛋白表达.用5μmol/L 5-Aza-CdR处理两种细胞系后,用同样的方法检测其甲基化水平及蛋白表达,观察药物的影响.结果:TIMP3基因在食管癌细胞系EC1和EC9706中均表现为非甲基化,蛋白呈现弱表达;而E-Cadherin基因在EC1中发生甲基化,EC9706中发生半甲基化,蛋白表达均缺失.5-Aza-CdR作用后的两种细胞系中,TIMP3基因仍为非甲基化,而蛋白表达似有所曾强;但E-cadherin基因甲基化得到了逆转,蛋白表达由原来的不表达,转变为强表达.结论:5-Aza-CdR能够有效逆转E-cadherin基因甲基化,并使其蛋白恢复表达;TIMP3基因的失活似与甲基化机制无关,5-Aza-CdR对其蛋白表达的恢复作用微弱.
关键词： 食管瘤 甲基化 5-aza-CdR TIMP3 E-cadherin -
miR-221与miR-222通过靶基因TIMP3调控胶质瘤细胞侵袭能力
目的 探讨miR-221和miR-222在胶质瘤细胞侵袭过程中的作用及其机制.方法 采用反义寡核苷酸下调miR-221和miR-222表达,Transwell、Western blot、荧光素酶实验及体内实验分别检测细胞侵袭能力、体内肿瘤生长、相关基因蛋白表达变化及靶基因鉴定.结果 下调miR-221和miR-222表达能明显抑制胶质瘤细胞侵袭能力,同时相关侵袭蛋白MMP2和MMP9表达下降.miRNA靶基因预测软件分析、Western blot、荧光素酶实验证实TIMP3是miR-221和miR-222的靶基因.裸鼠皮下肿瘤模型显示下调miR-221和miR-222表达抑制体内肿瘤生长.免疫组化发现TIMP3表达上调,MMP2和MMP9表达下调.结论 在胶质瘤细胞中,侵袭相关蛋白TIMP3是miR-221和miR-222的一个新靶基因.
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MiR-191靶向调控TIMP3促进肺癌细胞恶性转化进程的研究
目的 探索miR-191靶向调控基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭影响及相关机制,为深入了解肺癌发生发展机制及寻找新的诊断和治疗靶标提供新思路.方法 TargetScan软件预测miR-191的潜在靶基因;双荧光素酶报告实验检测miR-191对TIMP3调控作用;Western blot和实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测正常肺细胞CCD-19Lu和肺癌细胞A549中TIMP3、miR-191表达水平;肺癌细胞A549中转染anti-miR-191后检测TIMP3蛋白表达变化;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测细胞中MMP2、JNK、p-JNK、β-actin蛋白表达水平.结果 TargetScan预测软件发现TIMP3是miR-191的潜在靶基因;双荧光素酶报告实验证实TIMP3是miR-191的靶标;正常肺细胞CCD-19Lu中miR-191表达较低,TIMP3 mRNA表达较高;肺癌细胞A549中miR-191表达较高,TIMP3 mRNA表达较低;肺癌细胞A549中转染anti-miR-191可显著增加TIMP3蛋白表达;MTT结果显示肺癌细胞增殖未受明显影响;Transwell实验结果表明anti-miR-191可抑制细胞迁移和侵袭;Western blot结果显示TIMP3下游癌蛋白MMP2、p-JNK显著下调.结论 TIMP3是miR-191的一个靶标,肺癌中高表达的miR-191可靶向抑制TIMP3激活MMP2、JNK等癌基因促使肺癌细胞发生恶性转化;miR-191/TIMP3信号轴在肺癌恶性病变过程中可能起重要作用,可成为肺癌早期诊断与靶向治疗的分子靶标.
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胃癌患者TIMP3基因启动子区CpG岛甲基化状态及蛋白表达
目的 探讨胃癌组织中TIMP3基因启动子区CpG岛甲基化及蛋白的表达与胃癌生物学行为的关系,并分析TIMP3基因启动子区CpG岛甲基化与其蛋白表达的相关性.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)技术和免疫组织化学SP法检测45例患者的胃癌组织、正常胃黏膜组织中TIMP3基因启动子区CpG岛甲基化情况及蛋白的表达.结果 TIMP3基因启动子区CpG岛在胃癌及正常组织中的甲基化阳性率分别为31.1％和0(P＜0.05)；TIMP3蛋白在胃癌及正常组织中的阳性表达率分别为46.7％和90.5％ (P ＜0.05)；TIMP3基因启动子区CpG岛甲基化及蛋白的表达分别与胃癌的分化程度、淋巴结转移有关(P＜0.05).TIMP3基因启动子甲基化与蛋白表达呈明显的负相关(P＜0.05).结论 TIMP3基因启动子区CpG岛的异常甲基化是引起蛋白表达缺失的主要原因,TIMP3基因启动子区CpG岛的异常甲基化与胃癌的发生发展有关.
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急性白血病患者骨髓细胞RUNX3、TIMP3蛋白检测的意义
目的 探讨骨髓细胞RUNX3、TIMP3蛋白检测在急性白血病(Acute Leukemia,AL)患者预后评价的意义.方法 采用甲基化特异性PCR法检测50例AL患者骨髓单个核细胞及20例健康供血者外周血单个核细胞中TIMP3、RUNX3甲基化状态,随后采用Western blotting检测TIMP3、RUNX3表达情况,并分析TIMP3、RUNX3表达与AL预后的关系.结果 50例AL患者RUNX3甲基化阳性率为38%;甲基化组RUNX3蛋白表达量低于未甲基化组及健康对照组(P<0.05);AL患者与健康对照组TIMP3甲基化均为阴性;甲基化组完全缓解率低于未甲基化组(P<0.05).结论 RUNX3启动子区域甲基化可降低该蛋白的表达率,其与AL发病及不良预后密切相关,可作为AL辅助诊断及预后判断的可靠指标;TIMP3表达与AL发病无相关性.
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BAG1和TIMP3在结肠癌中的表达及临床病理意义
[目的] 探讨BAG1和TIMP3在结肠癌中的表达、两者相关性及临床病理意义.[方法] 采用免疫组织化学SABC法检测80例结肠癌组织和20例正常结肠黏膜中蛋白BAG1、TIMP3的表达.[结果] BAG1在结肠癌组织中阳性率(80%)显著高于正常组织的阳性率(10%)(P＜0.05);TIMP3在结肠癌组织中的阳性率43.75%,而在正常黏膜组织的阳性率为60%(P＞0.05).BAG1蛋白和TIMP3的表达与结肠癌分化程度、Duke's分期、淋巴结转移及生存率密切相关(P＜0.05),与性别、年龄无关(P＞0.05).蛋白BAG1与TIMP3表达无相关性(P＞0.05).[结论] 蛋白BAG1高表达和TIMP3表达缺失对结肠癌的发生发展均起重要作用,两者表达水平与结肠癌的浸润转移及恶性程度有关.BAG1和TIMP3可作为预测结肠癌浸润转移潜能的新的生物学指标.
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miR-181b及其关键靶基因PTEN和TIMP-3在肝细胞肝癌中的表达和意义
目的:研究miR-181b对PTEN和TIMP3基因表达的影响,探讨其在肝细胞肝癌(HCC)发生、发展中的作用及意义.方法:应用免疫组化和实时荧光定量PCR检测30例HCC及相应癌旁组织,10例正常肝脏组织中miR-181b、PTEN、TIMP-3表达情况,分析miR-181b、PTEN和TIMP-3的表达水平与HCC临床病理特征之间的关系.探讨miR-181b水平与PTEN、TIMP3表达的相关性.结果:在HCC组织中PTEN和TIMP-3的mRNA和蛋白的表达水平均明显低于癌旁组织及正常肝组织(P＜0 01),调控二者表达的miR-181b在HCC组织中的的表达明显增高.miR-181b、PTEN和TIMP-3的表达水平与HCC细胞的分化程度、血清中AFP表达水平、HBV感染明显有关,与患者年龄、性别、肿瘤大小等因素无关.结论:miR-181b在HCC中的表达量显著高于癌旁和正常肝组织,其表达水平与肿瘤组织细胞的分化程度、血清AFP水平及是否合并HBV感染明显相关;在HCC组织中,miR-181b的表达水平与PTEN、TIMP3的水平呈负相关.miR-181b可能通过靶向调控PTEN和TIMP3的表达来发挥其促进HCC侵袭转移的生物学作用.
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miR221/222家族在胶质瘤中的研究进展
神经胶质瘤是颅内常见的一种恶性肿瘤,它的发生、发展与MicroRNA的表观遗传修饰密切相关.miR221/222是一类保守的、非编码MicmRNA,并在胶质瘤中呈现非正常表达.miR221/222通过被NF-kB激活,抑制p27 kip1、PUMA、TIMP3、PTEN等抑癌基因的表达,从而调控胶质瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的侵袭能力,并通过与核转录因子NF-kB形成正反馈环路,不断增强其自身的作用.本文就miR221/222目前在胶质瘤中的研究进展进行综述.
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miR－21影响宫颈癌HeLa细胞生长和凋亡的机制探讨
目的：探讨miR－21如何通过对TIMP3表达的调控，从而影响HeLa宫颈癌细胞系的生长和凋亡。方法：转染miR－21抑制性核苷酸（AS－miR－21）下调HeLa细胞系中miR－21表达水平，MTT实验和流式细胞术分别检测细胞生长和凋亡，采用实时定量PCR（qRT－PCR）和Western blot测量TIMP3 mRNA和蛋白质表达水平变化，双荧光素报告系统检测miR－21对TIMP3的直接调节。AS－miR－21和TIMP3 siRNA共转染HeLa细胞系，MTT和流式细胞术检测细胞生长、凋亡的变化。结果：下调miR－21后，HeLa细胞的生长能力较对照组明显降低（P＜0．05），凋亡显著增加（P＜0．05），TIMP3 mRNA和蛋白质表达水平显著增高（P＜0．05）。双荧光素报告实验显示TIMP3受miR－21的直接调节。共转染AS－miR－21和TIMP3 siRNA可显著缓解下调miR－21引起的生长抑制和凋亡诱导。结论：miR－21可通过调节TIMP3的表达水平，参与调节宫颈癌细胞生长和凋亡。本研究结果提示miR－21在宫颈癌恶性生物学进程中可能发挥重要作用。
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甲状腺乳头状癌与基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化的关系研究
目的：研究基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化水平与甲状腺乳头状癌发生的内在联系，建立基于启动子高甲基化抑癌基因的甲状腺乳头状癌早期诊断方法。方法收集甲状腺手术切除的组织标本共46例，其中甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）29例，结节性甲状腺肿（nodular goiter ）17例。经提取 DNA，设计并合成 BSP 引物，PCR 扩增，采用亚硫酸氢盐法克隆测序（bisulfite sequencing）和 Sequenom Mass ARRAY 甲基化 DNA 定量分析法检测甲状腺乳头状癌组织 TIMP3基因启动子 CpG 片段的甲基化水平。结果亚硫酸盐修饰测序结果显示 TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织中的高甲基化克隆百分比为70％，显著高于结节性甲状腺肿的0％（P ＜0．05）。TIMP3基因启动子区5个 CpG 位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化有呈较高的甲状腺乳头状癌特异性。Sequenom Mass ARRAY 提供的单一 CpG 位点甲基化定量数据显示 TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织的甲基化率均值（0．28）高于结节性甲状腺肿的甲基化率均值（0．15），差异有统计学意义（P ＜0．05）。TIMP3基因启动子3个 CpG 位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化率均值高于结节性甲状腺肿甲基化率，差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论TIMP3基因 CpG-16及 CpG-17位点可能为甲状腺乳头状癌的启动子甲基化检测的关键位点，有望成为甲状腺癌早期诊断的分子标志物。
